壯藥金邊螞蟥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

陸崢琳， 黃瑞松*， 潘紅平， 蘇 青， 周維海

(1.廣西民族醫(yī)藥研究院，廣西南寧 530001;2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005;3.南寧市科康生物科技有限責(zé)任公司，廣西南寧 530007)

金邊螞蟥系醫(yī)蛭科動(dòng)物菲牛蛭Poecilobdella manillensisLesson的干燥全體。原動(dòng)物在我國(guó)主要分布于福建、臺(tái)灣、廣東、廣西、海南和香港［1］，廣西全區(qū)各地均有分布，現(xiàn)廣西已有人工養(yǎng)殖［2-4］。金邊螞蟥為廣西壯醫(yī)使用的藥材，俗名螞蟥、水蛭、肉鉆子、馬鱉、水麻貼等。壯醫(yī)認(rèn)為，其可調(diào)龍路，散瘀腫，用于京瑟(閉經(jīng))、唄農(nóng) (瘡癰)、麻邦 (中風(fēng))、扭像(扭挫傷)等癥［5］。文獻(xiàn)記載，本品為吸血類牛蛭，主要含天然水蛭素和類組織胺合物［6-8］，其中水蛭素具有抗凝、纖溶、抑制血小板聚集、降低全血黏度、降血脂、抗血栓等作用［9-13］。目前《中國(guó)藥典》尚未收入本品，該藥材一直處于無(wú)標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)中，致使該藥材使用和檢驗(yàn)無(wú)標(biāo)準(zhǔn)可依，難以控制該藥材質(zhì)量，影響臨床用藥的安全有效。為進(jìn)一步開發(fā)利用金邊螞蟥資源，本實(shí)驗(yàn)收集了不同批次的樣品，對(duì)其藥材性狀、TLC鑒別、水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、酸堿度、抗凝血酶活性的定量等進(jìn)行研究，制訂金邊螞蟥質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

硅膠G、H薄層板 (海洋牌，青島海洋化工廠分廠，批號(hào)20110608;銀龍牌，煙臺(tái)化工研究所，批號(hào)20110412)，800型離心沉淀器 (上海手術(shù)器械廠)，1/105分析天平 (X205BDU，瑞士梅特勒公司)，雷磁PHS-3C測(cè)試儀 (上海精密科學(xué)儀器有限公司)， (牛)纖維蛋白原 (Sigma公司，F(xiàn)8630 9001-32-5)，凝血酶凍干粉 (河南欣泰有限公司，批號(hào)20090703)，水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。金邊螞蟥對(duì)照藥材采自陸川縣米場(chǎng)鎮(zhèn)南中村，其余10批次藥材采集地見表1，樣品均經(jīng)過(guò)廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院潘紅平教授鑒定為醫(yī)蛭科動(dòng)物菲牛蛭Poecilobdella manillensisLesson。

表1 10批金邊螞蟥產(chǎn)地和收集時(shí)間Tab.1 Habitats and collecting time of Poecilobdella manillensis Lesson

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀特征 見圖1。呈長(zhǎng)橢圓形、長(zhǎng)條形，扭曲或扁平，柳葉狀，長(zhǎng)4～13 cm，體寬0.3～1.2 cm，體厚0.05～0.1 cm。背部黑色或黑褐色，有少許環(huán)節(jié)突起;腹面黑色，較光滑。前端略尖，后端鈍圓，兩端各具一吸盤，前吸盤不顯著，后吸盤圓大。質(zhì)脆，斷面膠質(zhì)狀，黑色。氣腥臭，味咸。

2.2 薄層鑒別一

2.2.1 供試品和對(duì)照藥材溶液制備 取10批金邊螞蟥藥材各1 g，加乙醇5 mL，超聲處理15 min，濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液;另取金邊螞蟥對(duì)照藥材1 g，同上法制成對(duì)照藥材溶液。

圖1 金邊螞蟥藥材Fig.1 Materia medica of Poecilobdella manillensis Lesson

2.2.2 薄層鑒別及結(jié)果 照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取供試品溶液2～4 μL，對(duì)照藥材溶液3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G預(yù)制板 (青島海洋化工廠)上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯 (4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果表明，10批供試品色譜中，日光下檢視在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn);紫外光燈 (365 nm)下檢視則顯相同的橙色熒光斑點(diǎn)。本方法分離效果好，斑點(diǎn)集中清晰，比移值適中，重現(xiàn)性好。見圖2、3。

圖2 金邊螞蟥TLC圖 (可見光色譜)Fig.2 TLC chromatogram of Poecilobdella manillensis Lesson(visible chromatography)

2.3 薄層鑒別二

2.3.1 供試品、對(duì)照藥材和對(duì)照品溶液制備 取10批金邊螞蟥藥材各1 g，加70%乙醇5 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液;另取金邊螞蟥對(duì)照藥材1 g，同上法制成對(duì)照藥材溶液;再取亮氨酸對(duì)照品、纈氨酸對(duì)照品、丙氨酸對(duì)照品、谷氨酸對(duì)照品，加70%乙醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

圖3 金邊螞蟥TLC圖 (紫外光色譜)Fig.3 TLC chromatogram of Poecilobdella manillensis Lesson(UV chromatography)

2.3.2 薄層鑒別及結(jié)果 照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取供試品溶液3～8 μL，對(duì)照藥材溶液4 μL，混合對(duì)照品溶液1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G預(yù)制板 (青島海洋化工廠)上，以苯酚-水 (3∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果表明:10批供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，本方法分離效果好，斑點(diǎn)集中清晰，比移值適中，重復(fù)性好。見圖4。

圖4 金邊螞蟥TLC色譜圖 (可見光色譜)Fig.4 TLC chromatogram of Poecilobdella manillensis Lesson(visible chromatography)

2.4 檢查 水分、總灰分、酸不溶性灰分、酸堿度和醇溶性浸出物的測(cè)定分別參照2010年版《中國(guó)藥典》一部附錄ⅨH水分測(cè)定法第一法、IX K灰分測(cè)定法、Ⅶ G酸堿度測(cè)定法、X A醇溶性浸出物測(cè)定法中的熱浸法進(jìn)行。結(jié)果見表2。

表2 10批金邊螞蟥水分、總灰分、酸不溶性灰分、酸堿度及乙醇浸出物含有量的測(cè)定Tab.2 Water content，total ash，acid-insoluble ash ，pH value and alcohol-solubleextracts of Poecilobdella manillensis Lesson

2.5 抗凝血酶活性測(cè)定

2.5.1 測(cè)定方法 采用凝血酶滴定法:取金邊螞蟥藥材粉末約0.5 g，精密稱定，精密加入0.9%氯化鈉溶液15 mL，充分?jǐn)嚢?，浸?5 min，并時(shí)時(shí)振搖，離心，精密量取上清液100 μL，置于小試管中，加入含0.5%纖維蛋白原 (以凝固物計(jì))的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液 (取0.2 mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液25 mL與0.1 mol/L鹽酸溶液約40 mL，加水至100 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.4)200 μL，搖勻，置水浴 (37℃ ±0.5℃)中以每分鐘5 μL的速度緩緩滴加凝血酶溶液 (40單位/mL)，邊滴加邊輕輕搖勻，至凝固，記錄消耗凝血酶溶液的體積，按下式計(jì)算:U=C1V1/C2V2。U為每1 g含凝血酶活性單位。中和一個(gè)單位的凝血酶的量，為一個(gè)抗凝血酶活性單位;C1(U/mL)為凝血酶溶液濃度;C2(g/mL)為供試品溶液質(zhì)量濃度;V1(μL)為消耗凝血酶溶液的體積;V2(μL)為供試品溶液的加入量。

2.5.2 方法學(xué)考察

2.5.2.1 專屬性試驗(yàn) 按上述測(cè)定方法，不加金邊螞蟥藥材粉末制備供試液，滴加凝血酶溶液，供試液不會(huì)凝固。說(shuō)明用本方法測(cè)定金邊螞蟥藥材抗凝血酶活性無(wú)陰性溶劑干擾，專屬性強(qiáng)。

2.5.2.2 精密性試驗(yàn) 取同一對(duì)照藥材供試品溶液6份，按2.5.1項(xiàng)的方法分別測(cè)定。結(jié)果顯示，6次測(cè)定的抗凝血酶活性平均值為269.2 U/g，RSD為0(n=6)。

2.5.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一對(duì)照藥材粉末6份各0.5 g，精密稱定，按2.5.1項(xiàng)平行測(cè)定6次。結(jié)果顯示，6份樣品的抗凝血酶活性平均值為269.3 U/g，RSD 為0.12%(n=6)。

2.5.3 樣品測(cè)定 取10批次金邊螞蟥藥材，按2.5.1項(xiàng)方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表3。

表3 10批金邊螞蟥抗凝血酶活性測(cè)定結(jié)果 (n=2，按干燥品計(jì))Tab.3 Results of antithrombin activity of Poecilobdella manillensis Lesson(n=2，Calculate according to drying products)

3 討論

2010年版《中國(guó)藥典》一部收載的水蛭藥材為水蛭科動(dòng)物螞蟥Whitmania pigraWhitman、水蛭Hirudo nipponicaWhitman或柳葉螞蟥Whitmania acranulataWhitman［14］。《中國(guó)藥典》收載的水蛭都是非吸血類，其性狀背部黑褐色或黑棕色，腹面棕黃色。試驗(yàn)所用金邊螞蟥則為吸血類，其全身均為黑褐色，與《中國(guó)藥典》收載的水蛭外觀性狀有區(qū)別。

薄層鑒別方法一，展開劑比較了環(huán)己烷-乙酸乙酯 (4∶1)、正己烷-乙酸乙酯 (4∶1)、石油醚-三氯甲烷 (1∶1)。結(jié)果環(huán)己烷-乙酸乙酯 (4∶1)系統(tǒng)分離得到的斑點(diǎn)顯色后清晰，Rf值適中。顯色方式比較了3種:10%硫酸乙醇溶液顯色后分別置于日光及紫外光燈 (365 nm)下觀察、5%磷鉬酸溶液顯色后日光下觀察及硫酸-醋酸酐 (1∶3)溶液顯色后分別置于日光下及紫外光燈 (365 nm)下觀察。結(jié)果采用10%硫酸乙醇溶液顯色，主斑點(diǎn)顯色清晰;5%磷鉬酸溶液顯色有背景干擾;硫酸-醋酸酐 (1∶3)溶液顯色，日光下主斑點(diǎn)欠清晰，紫外光燈 (365 nm)下有背景干擾。

薄層鑒別方法二，展開劑比較了苯酚-水(3∶1)、正丁醇-醋酸-甲酸-水 (4 ∶1 ∶0.1 ∶1)、正丁醇-冰醋酸-水 (3∶1∶1)三種。結(jié)果以苯酚-水 (3∶1)展開較其余二者效果好，故采用之。

本實(shí)驗(yàn)還對(duì)TLC鑒別方法進(jìn)行了耐用性試驗(yàn)，即對(duì)不同品牌預(yù)制板 (青島海洋化工廠提供，批號(hào)20110608;煙臺(tái)市化工研究所提供，批號(hào)20110412)、不同展開溫、濕度 (溫度8℃或30℃，相對(duì)濕度50%或88%)和點(diǎn)樣方式 (點(diǎn)狀和條帶狀點(diǎn)樣)等展開效果進(jìn)行考察。結(jié)果上述各種條件下的展開效果均較好，表明本方法的耐用性良好。

由表2可知，10批金邊螞蟥藥材水分在7.6%～14.3%，平均水分為10.2%?？紤]到該藥材為南方所產(chǎn)，而南方氣候較為濕潤(rùn)，藥材在運(yùn)輸和貯存過(guò)程中發(fā)生變化等因素，因此，將本品水分?jǐn)M訂為不得過(guò)15.0%。10批樣品的總灰分為1.7%～3.8%，平均值為2.5%;酸不溶性灰分為0.1%～0.3%，平均值為0.2%;pH值為5.9～7.3，平均值為6.7;醇溶性浸出物含有量為9.4%～21.7%，平均值為16.0%。因此將本品總灰分?jǐn)M定為不得過(guò)6.0%，酸不溶性灰分為不得過(guò)0.5%，pH值為5.5～7.5，浸出物含有量為不少于8.0%。

金邊螞蟥主要含天然水蛭素和類組織胺［6-8］，其中水蛭素具有抗凝、纖溶、抑制血小板聚集、降低全血黏度、降血脂、抗血栓等作用［9-13］，是該藥材的主要有效成分，故本實(shí)驗(yàn)研究制訂了抗凝血酶活性的定量測(cè)定方法。該方法中有關(guān)樣品供試液制備，采用正交試驗(yàn)方法，對(duì)樣品不同取樣量、不同提取時(shí)間、氯化鈉溶液不同加入量等三因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素設(shè)定三水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，考察指標(biāo)為每1 g藥材所含抗凝血酶活性單位。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定供試液制備方法如2.5.1項(xiàng)。文獻(xiàn)報(bào)道，寬體金線蛭Whitmania pigraWhitman、日本醫(yī)蛭Hirudo nipponicaWhitman和菲牛蛭Poecilobdella manillensisLesson均有不同程度的抗凝血酶活性，采用冷浸和溫浸提取，抗凝血酶活性大小為菲牛蛭＞日本醫(yī)蛭＞寬體金線蛭［15］。由表3可知，10批金邊螞蟥藥材抗凝血酶活性為244.8～298.7 U/g，平均含有量為267.2 U/g。該結(jié)果較文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)高，考慮到藥材來(lái)源的差異，限度擬定為:本品每1 g含抗凝血酶活性應(yīng)不低于220.0 U(按干燥品計(jì))。

本研究制訂的金邊螞蟥藥材質(zhì)量控制方法，現(xiàn)已收入《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》第二卷(2011年版)［5］，對(duì)控制該藥材質(zhì)量有著積極的作用。

［1］楊 潼.中國(guó)動(dòng)物志 (環(huán)節(jié)動(dòng)物門·蛭綱)［M］.北京:科學(xué)出版社，1996:120-122.

［2］周維官，周維海，覃國(guó)森.菲牛蛭的人工養(yǎng)殖方式試驗(yàn)［J］.廣西科學(xué)，2008，15(3):317-320.

［3］周維官，周維海，關(guān)建聰.等.菲牛蛭的研究進(jìn)展［J］.廣西科學(xué)院學(xué)，2010，26(1):74-77.

［4］周維官，周維海，丘 毅，等.菲牛蛭規(guī)范化養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)［J］.中藥材，2011，34(9):133`-1335.

［5］廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局.廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，第二卷［S］南寧:廣西科學(xué)技術(shù)出版社，2011:183-184.

［6］楊恩昌.水蛭素可利用性分［J］.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，14(7):52-53.

［7］黃愛民，黎肇炎，廖共山.等.菲牛蛭素體內(nèi)外抗凝實(shí)驗(yàn)研究［J］.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23(1):30-32.

［8］方富永，苗艷麗，蘇舒華，等.雙水相萃取-凝膠色譜聯(lián)用法提取菲牛蛭中的水蛭素［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2012，47(7):489-494.

［9］修 霞，聶海燕，韓紅霞，等.水蛭化學(xué)成分及其藥理作用探討綜述［J］.中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2005，5(8):1733-1734.

［10］陳華友，黃 靜，蔣芝君，等.抗凝良藥水蛭素的研究進(jìn)展［J］.生物學(xué)通報(bào)，2003，38(3):390-393.

［11］滕 磊，白秀萍.水蛭素對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血流變學(xué)的影響［J］.血栓與止血學(xué)，2012，18(4):179-181.

［12］關(guān)世俠，袁中文，周郁斌，等.不同品種水蛭抗凝抗血栓作用的比較［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32(14):1093-1096.

［13］張 彬，汪 波，龔 元，等.幾種水蛭抗凝血物質(zhì)提取及活性分析［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2012，51(4):92-96.

［14］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:78.

［15］歐興長(zhǎng)，張秋海，丁家欣，等.四種水蛭抗凝血酶作用的研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1996，8(2):54-56.