多花野牡丹精制提取物中有機(jī)酸定性分析及檸檬酸定量測定

王起運(yùn)， 曾佳烽， 方 通， 潘俊芳， 張朝暉*

(1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013;2.上海華拓醫(yī)藥科技發(fā)展股份有限公司，上海 201201)

多花野牡丹Melastoma affineD.Don為野牡丹科野牡丹屬植物，主要分布在我國的西南或南部地區(qū)［1-2］。臨床研究表明多花野牡丹水煮濃縮得到的浸膏對輕度、中度和重度宮頸糜爛都有很好的療效，300例患者中治愈率為99.33%，有效率為100%［3-4］。多花野牡丹水提取物，經(jīng)精制、純化得到的有效部位，是婦科賽菲凝膠的主要成分。該精制提取物水溶液的pH為2～3，預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，其中含有多種有機(jī)酸。賽菲凝膠在陰道中形成的弱酸性環(huán)境可以抑制有害病菌的生長，有利于消除感染，有機(jī)酸是其主要的有效成分之一。對多花野牡丹精制提取物用RP-C18柱進(jìn)行了HPLC分析，沒食子酸可以得到較好的分離，經(jīng)測定含有量為2.7%，但其他有機(jī)酸親水性強(qiáng)，用RP-C18柱難以進(jìn)行有效的定性和定量分析。

離子色譜法是20世紀(jì)70年代中期誕生的一項(xiàng)分析測試技術(shù)，能同時(shí)分離測定多種有機(jī)酸和無機(jī)陰離子，操作簡單，靈敏度高，在環(huán)境、食品、生物醫(yī)學(xué)、制藥、日化等領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用［5-11］。目前，還沒有人用離子色譜方法對多花野牡丹中有機(jī)酸進(jìn)行系統(tǒng)的分析。本實(shí)驗(yàn)用Ion Pac AS11-HC色譜柱對多花野牡丹精制提取物中親水性有機(jī)酸進(jìn)行了分離，并對其中含有量較高的檸檬酸進(jìn)行了定量測定。

1 儀器及試藥

Dionex ICS-2100型離子色譜儀 (戴安，美國)，配EGCⅡ KOH淋洗液自動(dòng)發(fā)生器，Thermo IonPac AS11-HC(4 mm×250 mm)分離柱，Thermo Dionex IonPac TM AG11-HC(4 mm×50 mm)保護(hù)柱;Chromeleon 6.80色譜工作站，電化學(xué)發(fā)生抑制器，恒溫電導(dǎo)檢測器。

乙酸鈉、乳酸、甲酸、丙酮酸、L(+)酒石酸、DL-蘋果酸、草酸、富馬酸、檸檬酸、NaF、無水 Na2SO4、NaNO2、KNO3、Na3PO4·12H2O、KCl購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，檸檬酸對照品 (批號:111679-200401)購自中國藥品生物制品檢定所。

2 溶液制備

2.1 混合對照品貯備液 分別取適量分析純試劑乙酸鈉、乳酸、甲酸、丙酮酸、L(+)酒石酸、DL-蘋果酸、草酸、富馬酸、檸檬酸、NaF、NaNO2、無水 Na2SO4、KCl、KNO3、Na3PO4·12H2O 用水溶解，制成1 mg/mL的貯備液，一周內(nèi)使用。臨用時(shí)分別精密移取上述貯備液至量瓶中，用水定容，得到檸檬酸20 μg/mL、F－為3 μg/mL、Cl－為4 μg/mL、其他對照品為10 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液 多花野牡丹葉片經(jīng)水提、80%乙醇醇沉，醇沉上清液減壓濃縮后上D101大孔樹脂柱，水洗液減壓濃縮即得精制提取液 (該提取液由海南華拓天涯制藥有限公司提供，批號20111201，每克含3.57 g生藥)，減壓濃縮至干。精密稱取上述干燥物76.30 mg于10 mL量瓶中，去離子水溶解定容;用移液管精密量取1 mL至5 mL量瓶中，去離子水定容，得1.53 mg/mL樣品溶液。經(jīng)PT-系列固相萃取柱和0.45 μm濾膜過濾，濾液作為供試品溶液1。多花野牡丹精制提取液 (批號20120301，20120302)為自行按照工藝制備，同上法處理，得供試品溶液2和供試品溶液3。

3 多花野牡丹中有機(jī)酸定性

3.1 離子色譜條件 ICS2100型離子色譜儀:35℃;進(jìn)樣量25 μL;由EGCⅡ KOH淋洗液自動(dòng)發(fā)生器生成1～40 mm/L KOH梯度淋洗液;體積流量1.0 mL/min;抑制電流為75 mA;電導(dǎo)檢測器檢測。

3.2 淋洗液濃度的選擇 有機(jī)酸和無機(jī)陰離子的色譜保留性質(zhì)存在較大差異，弱保留的一元酸如乳酸、乙酸、甲酸、丙酮酸等，中等保留的二元酸如蘋果酸、酒石酸、草酸、富馬酸等，強(qiáng)保留酸如檸檬酸等，對于強(qiáng)弱保留不同的離子，只能采用梯度淋洗，等度淋洗會(huì)出現(xiàn)多種組分共同淋洗下來的現(xiàn)象，在分析有機(jī)酸的時(shí)候，還要避免無機(jī)離子的干擾。

IonPac AS11-HC型陰離子分離樹脂柱的填料是親水的微孔薄殼型陰離子交換樹脂，基核是乙基乙烯基苯的聚合物，離子交換功能基是季銨基-N+(ROH)3，親水性較強(qiáng)［6，12］。本實(shí)驗(yàn)采用 EGCⅡKOH淋洗液自動(dòng)發(fā)生器在線生成高純度的KOH淋洗液，可以避免雜質(zhì)污染，保證淋洗液濃度的準(zhǔn)確，最大限度降低淋洗時(shí)的基線漂移和淋洗液濃度在線變化，平衡時(shí)間短，可方便實(shí)現(xiàn)梯度淋洗。梯度淋洗程序見表1。

表1 有機(jī)酸及無機(jī)陰離子的KOH溶液梯度淋洗程序Tab.1 KOH gradient elution program of organic acids and inorganic anions

3.3 色譜分離情況 圖1為有機(jī)酸、無機(jī)陰離子混合對照溶液色譜圖，圖2為多花野牡丹精制提取物的色譜圖。從圖1可知，在考察的有機(jī)酸種類中，草酸和富馬酸部分重疊，其余組分均達(dá)到完全分離，且 常見的 Cl－、NO－、NO－、SO2－、234PO43－等無機(jī)陰離子與所測定的有機(jī)酸的保留時(shí)間不同。與對照溶液的圖譜對比，多花野牡丹精制提取物色譜圖中，在乳酸和乙酸出峰的位置可能因糖類的多羥基成分的干擾，致使F－、乳酸和乙酸未能達(dá)到基線分離。

4 多花野牡丹提取物中檸檬酸定量測定

4.1 離子色譜條件 ICS2100型離子色譜儀;35℃;進(jìn)樣量25 μL;由EGCⅡ KOH淋洗液自動(dòng)發(fā)生器生成35 mm/L KOH梯度淋洗液;體積流量1.2 mL/min;抑制電流為104 mA;電導(dǎo)檢測器檢測。

圖1 混合對照溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed control ions

圖2 樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of samples

4.2 方法與結(jié)果

4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 取檸檬酸對照品 (批號:111679-200401)適量，精密稱定，加去離子水制成每1 mL含100 μg的對照品溶液，精密移取上述溶液稀釋成含 5、10、20、30、40、50、60 μg/mL的檸檬酸對照品溶液，在上述實(shí)驗(yàn)條件下測定其線性范圍，并繪制峰面積Y(μs)對質(zhì)量濃度X(μg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得回歸方程為Y=0.061 4X+0.110 1(r=0.999 9)，線性范圍為5 ～60 μg/mL。

4.2.2 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取樣品9份 (批號:20111201)，分成低、中、高3組，每組3份，分別精密添加檸檬酸對照品 20 μg、25 μg、30 μg，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果總平均加樣回收率 (n=9)為100.27%，RSD為1.28%。表明本法具有良好的回收率。

4.2.3 精密度試驗(yàn) 配制20 μg/mL的檸檬酸對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得檸檬酸峰面積的RSD(n=6)為0.49%。表明儀器精密度良好。

4.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次 (批號:20111201)樣品6份，按2.2項(xiàng)下方法平行制備成6份供試品溶液，進(jìn)樣分析，測得檸檬酸的RSD(n=6)為0.87%。表明本法重復(fù)性良好。

4.2.5 樣品中檸檬酸測定 取不同批次提取的多花野牡丹樣品進(jìn)行檸檬酸定量測定，每一批樣品按2.2項(xiàng)下方法制備3份供試品溶液，進(jìn)樣分析，結(jié)果見表2。

表2 樣品中檸檬酸測定結(jié)果 (n=3)Tab.2 Contents of citric acid in the samples

5 結(jié)論

用離子色譜法對多花野牡丹精制提取物中有機(jī)酸的分析結(jié)果表明，多花野牡丹精制提取物中含有乳酸、乙酸、甲酸、蘋果酸、草酸、檸檬酸等親水性有機(jī)酸以及F－、Cl－、NO3－、SO4

2－等無機(jī)陰離子。其中檸檬酸的量大于3%，其余有機(jī)酸的量均低于1%。離子色譜法操作簡便、快速、分離度好、靈敏度高，可用于多花野牡丹精制提取物中親水性有機(jī)酸的定性定量分析。

通常，由于樣品中較大極性成分的干擾，RPC18柱HPLC法對極性強(qiáng)的有機(jī)酸進(jìn)行分析時(shí)存在一定的困難，而離子色譜法，能夠不受這些物質(zhì)的干擾，對有機(jī)酸的分析有著獨(dú)特的優(yōu)勢。

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