復凝聚法制備留蘭香油微囊的處方工藝研究

吳素香， 蘇 璇， 李智慧， 唐法娣， 王 硯

(1.浙江中醫(yī)藥大學，浙江杭州 310053;2.浙江大學醫(yī)學院，浙江杭州 310058)

留蘭香油是采用水蒸氣蒸餾法從留蘭香Memfha spicataL.帶花序的莖葉中提取得到的揮發(fā)油，香芹酮是最主要的成分，其次是檸檬烯［1］。留蘭香油對肺炎克雷伯桿菌和脂多糖引起的大鼠慢性阻塞性肺病模型的肺部炎癥、肺氣腫、杯狀細胞增生和氧化改變有改善作用，并對肺炎克雷伯桿菌和脂多糖 (LPS)引起的肺組織Nrf2蛋白表達增強有降低作用［2］。

揮發(fā)油易受空氣、光線及溫度的影響而變質(zhì)，常采用包合、微囊化及乳化等技術(shù)提高揮發(fā)油的穩(wěn)定性。以明膠和阿拉伯膠為囊材，采用復凝聚法制備微囊，具有產(chǎn)率和效率高，材料無毒、易生物降解、使用簡便等優(yōu)點。本實驗以明膠和阿拉伯膠為囊材，采用復凝聚法制備留蘭香油微囊，并對乳化劑、囊材濃度、囊芯與囊材比、成囊pH值、成囊溫度、固化劑及固化時間等進行篩選和優(yōu)化，目的在于尋找一種可能較顯著提高留蘭香油穩(wěn)定性的方法，為留蘭香油的新藥開發(fā)奠定基礎。

1 材料

1.1 實驗儀器 VLP—200冷凍真空干燥機 (美國thermo)，AG245電子天平 (瑞典Mettler Toledo)，GF—1型控時調(diào)速式高速分散器 (江蘇省海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)，DF—101S集熱式恒溫磁力攪拌器 (江蘇省金壇市岸頭國瑞實驗儀器廠)，320 pH計 (瑞典Mettler Toledo)，BX51型、CX31型光學顯微鏡 (日本Olympus)，KQ—400KDE高功率數(shù)控超聲波清洗器 (福州精科儀器儀表有限公司)，6890氣相色譜儀 (美國 Agilent)，5804(R)冷凍離心機 (德國Eppendorf)。

1.2 試藥 留蘭香油 (華源香料油廠，批號:20100511)，內(nèi)標正十一烷 (sigma，批號:22054，純度≥99.8%)，香芹酮對照品 ［sigma， (－)-Carvone，批號:22060，純度≥99.0%］，檸檬烯對照品 ［sigma， (+)-Limonene，批號:62118，純度≥99.0%］，阿拉伯膠和明膠 (化學純)，葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯 (麗水市卯上副食品)，胃蛋白酶 (1∶3 000) (蘇州吳縣生物化學廠)，胰蛋白酶(1∶250)(北京索萊寶科技有限公司)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 香芹酮和檸檬烯氣相色譜測定方法的建立［3］

2.1.1 氣相色譜條件 HP-5彈性石英毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，氫火焰離子化檢測器，程序升溫為初始溫度60℃，以2℃/min升溫至115℃，以5℃/min升溫至150℃，氣化室溫度250℃，檢測器溫度280℃，分流比為20∶1。

2.1.2 標準曲線的制備 取檸檬烯或香芹酮對照品適量，精密稱定，置10 mL量瓶中，加入正己烷至刻度，搖勻，即得檸檬烯或香芹酮對照品溶液。取內(nèi)標正十一烷適量，精密稱定，置25 mL量瓶中，加正己烷至刻度，搖勻，即得內(nèi)標正十一烷溶液。分別精密吸取 0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的檸檬烯或香芹酮對照品溶液置于5 mL量瓶中，分別精密加入0.2 mL內(nèi)標溶液，加入正己烷至刻度，搖勻。分別精密吸取0.2 μL注入氣相色儀譜，重復進樣2次。以對照品與內(nèi)標峰面積之比為縱坐標Y，以對照品質(zhì)量濃度C(μg/mL)為橫坐標X，繪制標準曲線，得檸檬烯的標準曲線方程為:Y=0.001 2X－0.005 6，r=0.999，線性范圍為41.7～1 042.5 μg/mL;香芹酮的標準曲線方程為:Y=0.001X－0.009 4，r=0.999，線性范圍為 102.8 ～2 570.0 μg/mL。

2.1.3 微囊中香芹酮和檸檬烯的測定 稱取胰蛋白酶1 g，用100 mL pH 7.2 PBS溶解。精密稱取微囊粉末0.5 g，置棕色瓶中，加入胰蛋白酶溶液10 mL，上覆2 mL正己烷，置37℃水浴中，保溫2 h，顯微觀察已破囊。用正己烷萃取3次，每次7 mL，渦旋30 s后，5 000 r/min離心10 min，合并萃取液，加入0.5 g無水硫酸鈉脫水，取上清液置25 mL量瓶中，加內(nèi)標溶液1 mL，加正己烷定容至25 mL。取0.2 μL進樣檢測。

2.2 評價指標

2.2.1 外觀形態(tài) 采用光學顯微鏡觀察微囊的外觀形態(tài)，并量取粒徑范圍，記錄500個微囊的粒徑。根據(jù)下述公式，計算微囊的平均算術(shù)粒徑D。其中N為在某個粒徑范圍內(nèi)的粒子數(shù);d為某粒徑范圍內(nèi)的平均粒徑。以一定范圍內(nèi)的微囊數(shù)目除以總數(shù)得其頻率。微囊以圓球形，形態(tài)飽滿、粒徑均勻、大小適宜為佳。

平均算術(shù)粒徑:D=Σ(Nd)/ΣN=(Nld1+N2d2+…+Nndn)/(N1+N2+…+Nn)

2.2.2 收率 指微囊的質(zhì)量與投入的囊材質(zhì)量和留蘭香油質(zhì)量之和的比值。收率越高，表明工藝損耗越少。

2.2.4 載藥量 載藥量=(微囊所含總藥量/微囊總量)×100%，以檸檬烯或香芹酮計。

2.3 微囊的制備 將留蘭香油加入預熱的50 mL明膠溶液或阿拉伯膠液中，高速分散使成乳液;將乳液倒入500 mL棕色瓶中，并加入預熱到相同溫度、相同體積的阿拉伯膠溶液或明膠溶液。100 r/min恒溫磁力攪拌10 min。用10%醋酸調(diào)節(jié)pH，再恒溫攪拌10 min;加入40℃蒸餾水200 mL，攪拌降溫至35℃左右，再置冰水浴中攪拌降溫至10℃左右，調(diào)節(jié)pH，加入固化劑固化。離心過濾，用蒸餾水洗滌，20 mL異丙醇脫水，干燥即得［4］。

2.4 乳化劑與高速攪拌時間的選擇 將適量留蘭香油加入50 mL 50℃3%明膠溶液或阿拉伯膠溶液中，用高速分散器于5 600 r/min高速攪拌2～4 min，顯微觀察 (×200倍)，結(jié)果以明膠為乳化劑，高速攪拌4 min的效果較好，乳滴均勻。說明對于留蘭香油，明膠的乳化能力優(yōu)于阿拉伯膠，因此選擇明膠作為乳化劑，高速攪拌4 min。見圖1。

圖1 明膠為乳化劑乳化4 min乳劑的顯微照片F(xiàn)ig.1 Micrograph of emulsion with gelatin as emulsifying agents and emulsifying 4 minuts

2.5 囊材質(zhì)量分數(shù)的篩選［5］固定明膠為乳化劑，阿拉伯膠與明膠溶液質(zhì)量比為1∶1，5 600 r/min高速攪拌4 min，成囊溫度為50℃，囊芯與嚢材比為1∶2(mL∶g)，成囊pH為4.0，戊二醛為固化劑，固化時間90 min，冷凍干燥。在不同的囊材質(zhì)量分數(shù)下制備微囊，顯微觀察 (×200倍)，并計算干微囊的收率。結(jié)果囊材質(zhì)量分數(shù)為1%～2%時微囊粒徑較小，有許多空囊，溶液很稀;5%～6%時存在很多裂囊，溶液較稠厚;嚢材質(zhì)量分數(shù)為3%～4%時粒徑較均一，雖然4%的收率比3%的高，但3%的囊壁比4%的厚，有利于進一步的條件篩選，所以囊材質(zhì)量分數(shù)暫定為3%。見圖2和表1。

圖2 3%囊材質(zhì)量分數(shù)微囊的顯微照片F(xiàn)ig.2 Micrograph of microcapsules of 3%wall material

表1 不同囊材質(zhì)量分數(shù)微囊形態(tài)及收率Tab.1 Effect of the wall material concentration on yield and morphology of microcapsules

2.6 囊芯與囊材比的篩選 固定囊材質(zhì)量分數(shù)為3%，其他條件同“囊材質(zhì)量分數(shù)的篩選”，在不同的囊芯與囊材比 (mL∶g)條件下制備微囊，顯微觀察 (×200倍)，并計算干微囊的收率。結(jié)果囊芯與囊材比為1∶1(mL∶g)時，微囊飽滿，收率最高。故囊芯與囊材比暫定為1∶1(mL∶g)。見圖3和表2。

圖3 囊芯與囊材比為1∶1微囊的顯微照片F(xiàn)ig.3 Micrograph of microcapsules with core∶wall of 1∶1

表2 不同囊芯與囊材比微囊的形態(tài)及收率Tab.2 Effect of the core/wall ratio on the morphology andyield of microcapsules

2.7 成囊pH的篩選 固定囊芯與囊材比為1∶1(mL∶g)，其他條件同“囊芯與囊材比的篩選”，在不同的成囊pH下制備微囊，顯微觀察 (×200倍)，并計算干微囊的收率，結(jié)果隨著成囊pH值的降低，微囊逐漸形成，pH 3.5～4.3時囊形較好，且微囊內(nèi)油滴清晰可見;同時，微囊的粒徑逐漸增大 (pH 3.5時粒徑最大)，這是由于pH值下降使明膠帶有更多的正電荷，明膠和阿拉伯膠發(fā)生強烈的相互作用，單核微囊容易相互碰撞，聚集成大的球狀多核微囊。pH 4.5～5.0收率低，基本回收不到微囊，pH 3.5～4.3范圍內(nèi)收率基本相同，故暫定成囊pH值為4.0。見圖4和表3。

表3 不同成囊pH微囊的收率Tab.3 Effect of different sacculation pH on yield of microcapsules

圖4 成囊pH值為4.0微囊的顯微照片F(xiàn)ig.4 Micrograph of microcapsules with sacculation pH of 4.0

2.8 成囊溫度的篩選［6］固定成囊pH值為4.0，其他條件同“成囊pH值的篩選”，在不同成囊溫度下制備微囊，顯微觀察 (×200倍)，并計算干微囊的收率，結(jié)果隨著溫度升高，微囊的粒徑逐漸減小，但溫度較低時，囊形較好，微囊收率也較高，綜合考慮留蘭香油易揮發(fā)損失的特點，選擇較低的成囊溫度40℃。見圖5和表4。

圖5 成囊溫度為40℃微囊的顯微照片F(xiàn)ig.5 Micrograph of microcapsules with sacculation temperature of 40℃

表4 溫度對微囊收得率的影響Tab.4 Effect of different sacculation temperatures on yield of microcapsules

2.9 固化劑的選擇 固定成囊溫度為40℃，其他條件同“成囊溫度的篩選”，對甲醛、戊二醛、葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯及甘油四種固化劑進行篩選。①加入37%甲醛0.5 mL，攪拌15 min，調(diào)節(jié)pH值8～9，固化1 h;②調(diào)節(jié)pH值至中性，加入25%戊二醛0.5 mL，固化0.5 h;③加入甘油2 mL，攪拌1 h;④加入 20%葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯 5 mL，固化 5 h［7-8］。結(jié)果甲醛及戊二醛固化效果較好，甘油及葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯的固化效果差，過濾后，囊壁坍塌，微囊相互黏連，但由于用甲醛作固化劑要調(diào)節(jié)pH值8～9，在該pH值條件下留蘭香油中的主要成分香芹酮的量會顯著降低，所以選擇戊二醛為固化劑。

2.10 固化時間的選擇 固定固化劑為戊二醛，其他條件同“固化劑的選擇”，在不同的固化時間下制備微囊，顯微觀察 (×200倍)，并計算干微囊的收率，結(jié)果固化時間對微囊的粒徑以及收率基本沒有影響，30 min已經(jīng)固化完全，所以固化時間定為30 min，以提高制備效率。見圖6和表5。

圖6 固化時間30 min微囊的顯微照片F(xiàn)ig.6 Micrograph of microcapsules with hardening time of 30 minutes

表5 不同固化時間對收得率的影響Tab.5 Effect of different hardening time on yield of microcapsules

2.11 干燥方法選擇［9］固定固化時間為30 min，其他條件同“固化時間的選擇”，制備3批微囊，分別采用冷凍干燥和30℃低溫干燥。結(jié)果冷凍干燥樣品呈微黃色粉末，質(zhì)地蓬松，但檸檬烯的包封率只有5%～7%，而低溫干燥樣品檸檬烯的包封率達40%。表明冷凍干燥過程中，在高真空狀態(tài)下，低沸點的檸檬烯有較大的損失，因此選擇低溫干燥的方法。結(jié)果見表6。

表6 冷凍干燥微囊的包封率 (n=3)Tab.6 Encapsulation efficiencies of spearmint oil in microcapsules by freeze-drying(n=3)

2.12 正交試驗優(yōu)化處方 正交試驗固定采用低溫干燥，其他條件同“干燥方法選擇”，根據(jù)單因素考察結(jié)果，選擇囊材質(zhì)量分數(shù)、囊芯與囊材比(mL∶g)以及成囊pH值三個因素，每個因素選定三個水平進行L9(34)正交試驗，以微囊外觀形態(tài)及香芹酮的包封率作為評價指標。綜合評分=包封率A(若為50%即為50分) ×0.95+微囊外觀形態(tài)得分B［B總分為5分，根據(jù)微囊的圓整度 (1分)、大小均勻度 (2分)和飽滿程度 (2分)評定］。因素水平表見表7，正交設計及方差分析見表8、9。正交試驗結(jié)果顯示嚢材質(zhì)量分數(shù)、囊芯與嚢材比以及成囊pH值對綜合評分沒有顯著性的影響。極差分析顯示成囊pH值的影響最大，其次是囊芯與嚢材比，最后是嚢材質(zhì)量分數(shù)。因此A2B2C3，即囊材質(zhì)量分數(shù)為3%，囊芯與囊材比(mL∶g)為3∶4，成囊pH 3.8為最佳處方工藝，在該條件下留蘭香油中香芹酮的包封率為20.97%。

表7 因素水平Tab.7 Factors and levels of orthogonal design tests

表8 正交試驗安排及結(jié)果Tab.8 Results of orthogonal tests

表9 方差分析Tab.9 Results of analysis of variance

2.13 驗證試驗 固定囊材質(zhì)量分數(shù)為3%，囊芯與囊材比 (mL∶g)為3∶4，成囊pH 3.8，其他條件同“正交試驗”，制備微囊3批，并對其載藥量、包封率、粒徑及其分布進行考察。3批微囊的包封率和載藥量見表10;微囊的算術(shù)平均徑為75.17 μm，約70%分布在50～90 μm 之間，見圖7、8。

表10 3批微囊樣品的包封率和載藥量(n=3)Tab.10 Encapsulation efficiencies and drug-loading rates of three batches of samples(n=3)

圖7 微囊粒徑分布直方圖Fig.7 Particle size distribution of microcapsules

圖8 微囊顯微照片F(xiàn)ig.8 Micrograph of microcapsules

2.14 優(yōu)化的處方工藝 經(jīng)上述試驗，所得的優(yōu)化處方工藝為:將留蘭香油加入到50 mL 40℃保溫的3%明膠溶液中，5 600 r/min高速分散4 min使成乳液;加入50 mL 3%阿拉伯膠溶液 (經(jīng)80℃水浴加熱1 h去除氧化酶，40℃預熱)，于40℃、100 r/min恒溫磁力攪拌10 min;加入1 mL甘油，再攪拌5 min，緩慢加入10%醋酸調(diào)節(jié)pH至3.8，攪拌10 min;加入30～40℃蒸餾水200 mL，攪拌降溫至30℃，迅速冰水浴冷卻至10℃以下，加入10%NaOH調(diào)節(jié)pH至中性，加入25%戊二醛溶液0.5 mL，攪拌30 min，5 000 r/min離心，抽濾，水洗2遍至無醛味，異丙醇20 mL脫水，30℃低溫干燥即得。

3 討論

復凝聚法是以兩種或多種帶有相反電荷的高分子材料作囊材，將芯材分散于囊材溶液中，在適當條件下 (如改變pH值或溫度)，使帶相反電荷的聚合物間由于靜電作用而相互吸引，溶解度降低并產(chǎn)生了相分離，凝聚形成微囊。常用的囊材為明膠與阿拉伯膠、海藻酸鹽與殼聚糖等，復凝聚法適合于難溶性藥物的微囊化。

吐溫－80為非離子表面活性劑，其HLB值為15.0，是常用的O/W乳化劑。曾試用吐溫－80為乳化劑制備微囊，但結(jié)果未得到微囊，在燒杯的底部有一層明膠。吐溫－80雖能提高囊芯物的分散度，但會削弱或剝奪囊材對囊芯的包裹，甚至不能形成微囊。因此在微囊制備過程中，要慎用表面活性劑。

加入固化劑戊二醛之前，需調(diào)節(jié)pH值至7～8。若不調(diào)節(jié)，固化效果不好，過濾后微囊黏連，即使冷凍干燥也無法形成蓬松的粉末;若調(diào)節(jié)pH值至8以上，微囊中留蘭香油的主要成分香芹酮的量顯著降低，所以調(diào)節(jié)pH值至中性。

比較丙酮、異丙醇和乙醇三種溶劑的脫水作用，丙酮的脫水作用最強，程度難以控制，異丙醇次之，乙醇的作用最緩和而消耗量也最大?？紤]到這一過程的可控性和溶劑的消耗量，后期處理中多采用異丙醇脫水。所以本文也選擇異丙醇作為脫水劑。另外，由于留蘭香油易溶于異丙醇，所以異丙醇在脫水的同時還兼有洗去微囊表面揮發(fā)油的作用。

將微囊于30℃恒溫干燥，結(jié)果微囊嚴重黏連，且干燥溫度越高或干燥時的空氣流速越快，微囊越容易結(jié)塊。為了減少黏連，在制備過程中加入少許甘油，以增加微囊的可塑性和剛性;另外，在固化前先將溫度降至30℃再用冰水浴冷卻，結(jié)果，微囊黏連的情況得到明顯改善。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，采取上述措施后，30℃低溫干燥的微囊可以用水分散。低溫干燥法制得的微囊，檸檬烯等低沸點的物質(zhì)基本得到了保留，以檸檬烯計留蘭香油的包封率達到40%。

由于水蒸氣蒸留法提取微囊中留蘭香油的回收率較低，所以微囊的包封率不以總揮發(fā)油計，而是以揮發(fā)油中的主要成分香芹酮或檸檬烯計。由于留蘭香油的成分分析和定量測定結(jié)果顯示，香芹酮是留蘭香油中的最主要成分，其質(zhì)量分數(shù)是檸檬烯質(zhì)量分數(shù)的3倍以上 (香芹酮約18%，檸檬烯約5%);以香芹酮和檸檬烯計的包封率不完全一致，檸檬烯的包封率大于香芹酮;冷凍干燥對檸檬烯的包封率影響較大。因此，正交試驗中在選擇低溫干燥的條件下，只測定香芹酮的包封率。香芹酮在偏堿性條件下不穩(wěn)定可能是導致其包封率較低的原因。留蘭香油主要成分的理化性質(zhì)還有待進一步研究。

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