護(hù)骨膠囊配伍和成骨細(xì)胞分化的正交設(shè)計

王曉東， 賈歡歡， 曾昭利， 曾 雯， 秦中華， 萬 超， 陸幸妍， 李青南，胡 彬

(1.廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨外科，廣東廣州 510080;2.廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣東廣州 510663;3.東莞萬成制藥有限公司，廣東東莞 523040;4.香港中文大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)學(xué)院干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)中心，香港;5.廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院新藥功能研究中心，廣東廣州 510006;6.紐約大學(xué)牙科生物材料和仿生學(xué)研究室，美國紐約 10010)

骨質(zhì)疏松癥 (Osteoporosis)是以骨量減少、骨微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨的脆性和骨折危險性增加的系列性多病因的一種全身骨骼疾?。?-2］。成骨細(xì)胞 (osteoblasts)作為骨形成的主要功能細(xì)胞，是目前大多數(shù)防治骨質(zhì)硫松癥藥物的主要靶細(xì)胞之一［3］。其合成分泌的堿性磷酸酶 (Alkaline phosphatase，AKP)被作為考察成骨細(xì)胞分化的主要指標(biāo)［4］。護(hù)骨膠囊是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下形成的國家中藥新藥 (新藥證書編號:國藥證字Z20040106)，研究發(fā)現(xiàn)護(hù)骨膠囊對原發(fā)性骨質(zhì)硫松癥有一定的防治作用［5］，但臨床反饋，老年人服藥量略微偏大。本實驗采用正交模擬法［6］和非線性混合效應(yīng)模型 (NONMEM)技術(shù)［7-9］，以AKP為考察指標(biāo)，優(yōu)化護(hù)骨膠囊的配伍組方。

正交模擬法是由上海中醫(yī)藥大學(xué)鄭青山教授提出，用以定量考察復(fù)方各組分的藥效貢獻(xiàn)及其配伍規(guī)律的藥效學(xué)實驗方法。遵循這種規(guī)律性設(shè)計，可以最少的實驗次數(shù)獲取最優(yōu)化的復(fù)方配伍［10］。

1 材料

1.1 藥物與試劑 護(hù)骨膠囊十味原藥材東莞萬成制藥有限公司提供;堿性磷酸酶 (AKP)測定試劑盒南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號:20100630。

1.2 動物 2月齡SD大鼠24只，雌雄各半，體質(zhì)量 (200±10)g，合格證號:0074494及0074528;SD乳鼠3只，合格證號:SCXK(粵)2008-0020，雌雄兼用，每只約15 g。均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.3 儀器 Microplate Reader 680酶標(biāo)儀，美國Biorad公司;J-D200倒置生物顯微鏡，深圳拓天儀器設(shè)備有限公司;Galaxy二氧化碳培養(yǎng)箱，英國RS Biotech公司。

2 方法

2.1 護(hù)骨膠囊原方組成 護(hù)骨膠囊由以下十味藥材組成:淫羊藿 (A)277.5 g，巴戟天 (B)277.5 g，骨碎補 (C)277.5 g，杜仲 (D)277.5 g，續(xù)斷 (E)277.5 g，制首烏 (F)347.5 g，熟地黃 (G)347.5 g，龜甲 (H)208.5 g，當(dāng)歸(I)208.5 g，山藥 (J)277.5 g。

表1 正交設(shè)計Tab.1 Orthogonal array

2.2 分組與給藥 護(hù)骨膠囊十個組分ABCDEFGHIJ按表1設(shè)計，組成12個組方，煎煮液濃縮至0.1 g/mL。每組2只大鼠灌胃0.2 mL/(kg·d)，雌雄各半，連續(xù)7 d。根據(jù)護(hù)骨膠囊的成人服用量，按照標(biāo)準(zhǔn)動物的等效劑量折算系數(shù)法［11］計算出護(hù)骨膠囊原藥材的大鼠給藥量，可以折算出每組大鼠的給藥量，計算結(jié)果見表2。各組給藥結(jié)束后30 min心臟取血，4 000 r/min離心15 min分離大鼠血清，將雌雄大鼠血清混合，采用血清藥理學(xué)的方法制成10%的含藥血清，作用于源自大鼠乳鼠頭蓋骨的原代培養(yǎng)至第3代的成骨細(xì)胞，檢測各組470 nm培養(yǎng)成骨細(xì)胞上清的AKP吸光度 (A)值［12-13］。數(shù)值大代表藥效越強。

表2 各組分二水平設(shè)置 (g/kg)Tab.2 Set 2 levels of each component(g/kg)

2.3 分析模型與原理［14］采用正交模擬法及NONMEM法評價模型對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用最簡單的A、B兩組分組方來說明此方法的原理，Eobs為實測效應(yīng)，E0表示基線效應(yīng);Ea和Eb為 A、B組分對復(fù)方效應(yīng)的期望貢獻(xiàn)值。

(1)基礎(chǔ)模型模型 (式1)，可確定各組分對復(fù)方的貢獻(xiàn)值大小 (Eexp)，即重要程度。

(2)固定效應(yīng)模型 (式2)，可確定各配伍組的相互作用 (Eab)。

(3)隨機效應(yīng)模型 (式3)，可分析個體間 (η)和個體內(nèi) (ε)變異 (Erand)大小。

(4)復(fù)方預(yù)測藥效模型 (式4)，可預(yù)測不同組方的效應(yīng) (Epred)，尋找最大藥效和最優(yōu)組方。

2.4 模型評價 采用單組分實驗結(jié)果及4種常規(guī)視圖對預(yù)測模型進(jìn)行評價［9］。

3 結(jié)果

3.1 成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察鑒定 原代細(xì)胞貼壁前呈均勻一致的球形，24 h左右開始貼壁，72 h完全貼壁，并且胞漿伸展，呈飽滿的多角形。10 d之后出現(xiàn)細(xì)胞融合，大多呈立方體形。

3.2 成骨細(xì)胞堿性磷酸酶 (AKP)檢測 條件培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)頭蓋骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞，以AKP作為成骨細(xì)胞分化的指標(biāo)，檢測發(fā)現(xiàn)使用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的上清液470 nm波長的A值0.164 0±0.003明顯高于使用普通培養(yǎng)基的A值0.034 3±0.002 1(P＜0.05)。

3.3 護(hù)骨膠囊模擬組方對成骨細(xì)胞分化的影響與原方 (第1組)比較，所有實驗組均有統(tǒng)計學(xué)差異 (P＜0.05)，且組4的A值大于組 1，見表3。

3.4 藥效學(xué)參數(shù)分析 復(fù)方藥效學(xué)參數(shù)列于下表，以基線效應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用DAS3.0軟件分析12個組的A值，比較各組分“用藥”與“不用藥”的藥效變化，確定各組分的重要性，實為該組分對復(fù)方的藥效貢獻(xiàn)值ED，反映各自重要程度［6］，結(jié)果見表4。由表4可以發(fā)現(xiàn)，有五味藥對成骨細(xì)胞分化有促進(jìn)作用，而骨碎補 (C)、何首烏 (F)對成骨細(xì)胞分化無作用 (P＞0.05)，續(xù)斷 (E)、龜甲 (H)、當(dāng)歸 (I)對成骨細(xì)胞分化則有抑制作用(ED＜0);各味藥對成骨細(xì)胞分化作用的影響大小，排序為淫羊藿 (A) ＞山藥 (J) ＞巴戟天(B)=熟地黃 (G)＞杜仲 (D)＞骨碎補 (C)＞何首烏 (F) ＞龜甲 (H) ＞當(dāng)歸 (I) ＞續(xù)斷(E)。

表3 各組血清培養(yǎng)成骨細(xì)胞470 nm A值 (±s，n=3)Tab.3 Absorbance values of each group serum culture osteoblast(±s，n=3)

表3 各組血清培養(yǎng)成骨細(xì)胞470 nm A值 (±s，n=3)Tab.3 Absorbance values of each group serum culture osteoblast(±s，n=3)

注:與原方 (第1組)比較，*P＜0.05。

配伍組號 A RSD/%1 0.184 0±0.011 5 6.3 2 0.166 7±0.013 0* 7.8 3 0.158 7±0.006 7* 4.2 4 0.187 0±0.011 5* 6.2 5 0.133 3±0.008 5* 6.4 6 0.158 7±0.010 5* 6.6 7 0.164 0±0.003 0* 1.8 8 0.146 7±0.007 2* 4.9 9 0.157 7±0.007 2* 4.6 10 0.143 0±0.006 9* 4.8 11 0.145 7±0.009 3* 6.4 12 0.141 0±0.007 0*5.0

表4 各組分對復(fù)方藥效的估計值Tab.4 Pharmacodynamic forecast values of composition

3.5 相互作用分析 不同組合，由于其劑量水平不一，其相互作用性質(zhì)和程序也有所不同，各配伍相互作用關(guān)系見表5。

3.6 復(fù)方藥效學(xué)模型評價 表6是在正交試驗12組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，采用正交模擬軟件DAS3.0對護(hù)骨膠囊不同組合的復(fù)方進(jìn)行藥效模擬，得出29個模擬組方，并進(jìn)行評價。通過藥效預(yù)測值Epred發(fā)現(xiàn)，29個預(yù)測組中最小效應(yīng)組合為組2(Epred為0.144 5);最大效應(yīng)組合為組1(Epred為0.226 3)，其次有5個組合的模擬藥效值接近于組1:組11(Epred為0.210 8)，組 15(Epred為0.204 9)，組 17(Epred為0.201 6)，組28(Epred為0.204 4)及組29(Epred為0.217 5)即原方，結(jié)果見表6及表7。

表5 不同組分配伍對的實測效應(yīng) (Eobs)、期望效應(yīng)(Eexp)與交互效應(yīng) (Eint)Tab.5 Eobs，Eexpand Eintof different compositions

3.7 預(yù)測模型評價［14］通過本實驗2種視圖的結(jié)果，說明各配伍組藥效均值 (Egroup)與預(yù)測值(Epred)的趨勢線與標(biāo)準(zhǔn)線吻合較好 (圖1)，具有較好的相關(guān)性;個體實測值 (Eobs)與個體預(yù)測值(Eipred)間關(guān)系一致 (圖2)。此外，個體實測值(Eobs)與群體預(yù)測值 (Epred)的變化趨勢一致。

表6 不同組方的藥效預(yù)測值Epred及其95%CITab.6 Predicted value pharmacodynamics of simulation compound Epredand 95%CI

表7 6個較好的模擬組方Tab.7 Six better simulation compounds of pesticide effect

復(fù)方藥效學(xué)模型具有預(yù)測能力，且實驗數(shù)據(jù)離散度小 (在±4內(nèi))，具有可預(yù)測性。以上均表明所建模型較好，具有預(yù)測能力。

4 討論

當(dāng)今，骨質(zhì)疏松癥已成為嚴(yán)重威脅人類生活質(zhì)量的疾病，國家已經(jīng)將其列為重點攻關(guān)的老年三大疾病之一［15］。基于中藥護(hù)骨膠囊對原發(fā)性骨質(zhì)疏松有良好的臨床療效，本實驗對處方配伍的優(yōu)化將進(jìn)一步拓寬其應(yīng)用前景。

本研究以AKP為指標(biāo)，結(jié)合正交模擬法理論上研究護(hù)骨膠囊十味藥的最佳配伍組合。以護(hù)骨膠囊各組分對復(fù)方藥效的貢獻(xiàn)值順序排列其重要程度，結(jié)果顯示，淫羊藿藥效的理論貢獻(xiàn)值大于其他藥味的貢獻(xiàn)值，進(jìn)一步證明了淫羊藿作為護(hù)骨膠囊君藥的科學(xué)性。同時，本實驗對不同模擬組合的復(fù)方進(jìn)行了藥效預(yù)測，發(fā)現(xiàn)29個模擬組中有6組具有較強的促分化作用:此排列順序為組方1、29(原方)、11、15、28和17，其中組方1只有原方中的6味藥，理論藥效最強，其值超過原組方。在組方構(gòu)成上減少了續(xù)斷 (E)、龜甲 (H)及當(dāng)歸(I)的組方1與護(hù)骨膠囊原方相比，對成骨細(xì)胞分化仍有較強的促進(jìn)作用。

圖1 各配伍組藥效均值 (Egroup)與預(yù)測值 (Epred)的相關(guān)性Fig.1 Correlation of efficacy mean(Egroup)and predicted mean(Epred)

圖2 個體實測值 (Eobs)與個體預(yù)測值(Eipred)間關(guān)系Fig.2 Relationships of individual measured values(Eobs)and predicted values(Eipred)

另一方面，根據(jù)各味藥對護(hù)骨膠囊復(fù)方藥效的理論貢獻(xiàn)值，發(fā)現(xiàn)續(xù)斷 (E)、龜甲 (H)及當(dāng)歸(I)對成骨細(xì)胞分化有抑制作用 (ED＜0)。

此外，本實驗室還采用成骨細(xì)胞增殖作為考察指標(biāo)［16］，利用正交模擬法分析了護(hù)骨膠囊十味藥在原組方中對成骨細(xì)胞增殖的貢獻(xiàn)程度，結(jié)合本次實驗結(jié)果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在原組方中，淫羊藿(A)、巴戟天 (B)、杜仲 (D)、熟地黃 (G)及山藥 (J)，這五味藥無論對成骨細(xì)胞的增殖還是分化都有較強的促進(jìn)作用;骨碎補 (C)只對成骨細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用 (P＜0.05)，而對分化無影響 (P＞0.05);何首烏 (F)對成骨細(xì)胞增殖及分化均無影響 (P＞0.05);續(xù)斷 (E)、龜甲(H)及當(dāng)歸 (I)對分化有抑制作用 (ED＜0)，但對增殖卻有一定的促進(jìn)作用 (P＜0.05)。

從上述正交模擬法分析護(hù)骨膠囊各味藥的貢獻(xiàn)值和不同模擬組合獲得復(fù)方藥效數(shù)據(jù)，用細(xì)胞分化和細(xì)胞增殖為指標(biāo)的各自實驗數(shù)據(jù)并不完全一致，提示護(hù)骨膠囊組方優(yōu)化上還需要中醫(yī)經(jīng)驗和中醫(yī)理論相結(jié)合分析和合理加減。

［1］Anis J A，Black D，Cooper C，et al.A new approach to the develoment of assessment guidelines for osteoporosis［J］.Osteoporosis Int，2002，13(7)，527-536.

［2］Cakir B，Odabasi E，Turan M，et al.Secondary osteoporosis in women.A retrospective analysis［J］.Arch Gynecol Obstet，2002，266(4):214-217.

［3］王洪復(fù).老年性骨質(zhì)疏松癥病理機制與防治原則［J］.中華保健醫(yī)學(xué)雜志，2010，12(1):1-4

［4］王洪復(fù).骨質(zhì)疏松癥藥效研究方法與技術(shù)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2009:29-30

［5］洪曼杰，盧 麗，王曉東，等.中藥復(fù)方護(hù)骨膠囊治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的臨床研究［J］.中國骨質(zhì)疏松雜志，2008，14(12):891-895

［6］鄭青山，何迎春，楊 娟，等.藥物相互作用分析與復(fù)方藥效模擬:一個方法學(xué)研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2007，23(8):841-847

［7］Mandema J W，Hermann D，Wang W P，et al.Model-based development of gemcabene， a new lipid-altering agent［J］.AAPS J，2005，7(3):513-522.

［8］Ette E I.Stability and performance of a population pharmacokinetic model［J］.Clin Pharmacol，1997，37(6):486.

［9］Bruno R，Vivier N，Vergniol J C，et al.A population pharmacokinetic model for docetaxel:model building and validation［J］.J Pharmacokinet Biopharm，1996，24(2):153.

［10］陳君超，潘友俊，李興珊，等.藥效學(xué)相互作用的定量計算方法與模擬研究［J］.中國中藥雜志，2008，33(16):2029-2033.

［11］徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:178-180

［12］李冬華，朱飛鵬.補腎中藥對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖和功能的影響［J］.中藥藥理與臨床，2005，21(2):32-34.

［13］陸幸妍，鄒燕燕，楊國柱，等.淫羊藿提取物對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的毒性試驗及細(xì)胞效應(yīng)研究［J］.中國中醫(yī)藥咨詢，2010，2(12):197-198.

［14］熊 倩，張 密，鄭青山.麻黃湯不同配伍對大鼠發(fā)汗作用的定量評價［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2011，16(7):763-767.

［15］楊雪平，陳 珺，盧 麗，等.短期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素對大鼠皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的不同影響［J］.中國骨質(zhì)疏松雜志，2010，16(4):265-269.

［16］賈歡歡，高建林，陳 珺，等.正交模擬法對護(hù)骨膠囊各組分藥效貢獻(xiàn)值及復(fù)方藥效模擬研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17(15):113-117.