八號(hào)膏對(duì)大鼠深I(lǐng)I度燙傷模型創(chuàng)面的治療作用及其機(jī)制研究

蘇 涌， 許杜娟，*， 高昌琨， 何家樂(lè)， 高 建，*， 宋禮華

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230032;2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥化學(xué)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室TCM-2009-202，安徽合肥230022;3.安徽安科生物工程 (集團(tuán))股份有限公司，安徽合肥 230032)

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院上世紀(jì)70年代開(kāi)發(fā)研制的八號(hào)燒傷膏是由大黃、五倍子、地榆、冰片等組成的中藥復(fù)方制劑，其療效經(jīng)臨床反復(fù)驗(yàn)證，對(duì)各種原因引起的燒傷，燙傷有良好的治療效果。八號(hào)膏目前仍是燒傷科在臨床治療各種燒傷中的主要藥物，但其作用機(jī)制不明，限制其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)使用。

現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)八號(hào)膏的主藥中大黃、地榆均有明顯的抗炎抗氧化作用［1-3］，由此推測(cè)八號(hào)膏可能通過(guò)抗炎抗氧化作用保護(hù)燙傷創(chuàng)面。本研究通過(guò)建立大鼠深I(lǐng)I度燙傷模型，從抗炎抗氧化的角度闡明其保護(hù)作用，為八號(hào)膏治療燙傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 八號(hào)膏 (由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科制備，批號(hào)20120110。處方組成為大黃、地榆、五倍子、爐甘石、赤石子、黃蠟、麻油、冰片。臨床用藥量設(shè)為高劑量，含生藥0.29 g/g;高劑量經(jīng)熟麻油稀釋一倍設(shè)為低劑量，含生藥0.14 g/g);濕潤(rùn)燒傷膏 (由北京光明中醫(yī)燒傷創(chuàng)瘍研究所、汕頭經(jīng)濟(jì)特區(qū)美寶制藥廠生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字0000004，批號(hào)1704103A);谷胱甘肽(GSH)測(cè)試盒 (南京建成生物工程研究所，批號(hào)20120324);黃嘌呤氧化酶 (XOD)測(cè)試盒 (南京建成生物工程研究所，批號(hào)20120322);白介素1β(IL-1β)檢測(cè)試劑盒 (上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)10634R)。

1.1.2 儀器與設(shè)備 電子天平 (FA2104，上海天平儀器廠);托盤(pán)天平 (WSZ-90-74，北京醫(yī)用天平廠);數(shù)顯恒溫水浴鍋 (江蘇金壇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠);Uquant全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 (美國(guó) biotek公司)。

1.1.3 動(dòng)物 SD大鼠，76只，雌雄各半，體質(zhì)量250～300 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。單籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與設(shè)計(jì) 76只SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量250～300 g，隨機(jī)分成八號(hào)膏高劑量組、八號(hào)膏低劑量組、濕潤(rùn)燒傷膏組、模型組、正常組。正常組12只，其余各組16只。根據(jù)燙傷后創(chuàng)面愈合的兩個(gè)不同時(shí)期，分別于傷后3 d和14 d獲取創(chuàng)面皮膚和血清標(biāo)本，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只，正常組6只。

1.2.2 深Ⅱ度燒傷模型的建立 燙傷前1 d，大鼠背部以10%硫化鈉脫毛，清水洗凈，擦干。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，自由飲水。自制直徑1 cm，長(zhǎng)25 cm鐵棒，一端光滑，做為燙傷面。實(shí)驗(yàn)時(shí)腹腔注射10%水合氯醛 (0.3 mL/100 g)麻醉大鼠。鐵棒預(yù)先置于沸水中30 min，取出后迅速擦干無(wú)外界壓力下置于大鼠背部，持續(xù)15 s，腹腔注射5 mL生理鹽水抗休克。燙傷后創(chuàng)面蒼白、腫脹，病理證實(shí)為深Ⅱ度燙傷。正常組鐵棒置于25℃水中，其余條件不變。

1.2.3 給藥 術(shù)后八號(hào)膏高、低劑量組和濕潤(rùn)燒傷膏組創(chuàng)面分別涂抹高、低劑量八號(hào)膏及濕潤(rùn)燒傷膏，高劑量組每次給藥約含生藥0.18 g，低劑量組每次給藥約含生藥0.09 g。大鼠單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。濕潤(rùn)燒傷膏每日換藥2次，八號(hào)膏每日換藥1次，每次換藥前新潔爾滅清洗殘藥，消毒，正常組與模型組只用新潔爾滅消毒。

1.2.4 創(chuàng)面含水量測(cè)定 燙傷后分別于3、14 d處死大鼠，以干濕質(zhì)量法測(cè)定創(chuàng)面含水量:剪取約100 mg創(chuàng)面，稱定質(zhì)量記為W1，隨后80℃烘箱內(nèi)干燥48 h，稱定質(zhì)量記為W2，按以下公式計(jì)算創(chuàng)面含水量，含水量 =(W1－W2)/W1×100%。

1.2.5 創(chuàng)面生化指標(biāo)測(cè)定 燙傷后3、14 d取創(chuàng)面組織，按質(zhì)量體積比1∶9加入預(yù)冷生理鹽水制成10%勻漿，3 000 r/min離心10 min取上清，按試劑盒要求檢測(cè)谷胱甘肽含有量及XOD活力。

1.2.6 IL-1β測(cè)定 燙傷后3 d后股動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10 min取上清，按試劑盒要求檢測(cè)IL-1β水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組數(shù)據(jù)采用表示，SPSS 11.0軟件進(jìn)行方差分析。采用LSD法統(tǒng)計(jì)組間差異性，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 八號(hào)膏對(duì)深I(lǐng)I度大鼠燙傷后3、14 d含水量的影響 燙傷后3 d模型組創(chuàng)面含水量明顯升高，14 d后含水量有所降低，但仍高于正常組 (P＜0.05)。八號(hào)膏高、低劑量組各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面含水量顯著低于模型組，但仍高于正常組 (P＜0.05)。八號(hào)膏高、低劑量與濕潤(rùn)燒傷膏組間無(wú)明顯差異(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 八號(hào)膏對(duì)深I(lǐng)I度大鼠燙傷創(chuàng)面含水量的影響(n=8，± s，%)Tab.1 Effect of Bahao Ointment on wound water content of deep partial-thickness burn rats(n=8，± s，%)

表1 八號(hào)膏對(duì)深I(lǐng)I度大鼠燙傷創(chuàng)面含水量的影響(n=8，± s，%)Tab.1 Effect of Bahao Ointment on wound water content of deep partial-thickness burn rats(n=8，± s，%)

注:與正常組相比，*P＜0.05;與模型組相比，△P＜0.05。下同。

傷后時(shí)間組 別3 d 14 d正常組 62.92±4.3860.83 ±4.40模型組 74.20±1.43* 72.07±1.54*八號(hào)膏高劑量組 71.17±1.09＊△ 67.57±1.86＊△八號(hào)膏低劑量組 70.86±2.03＊△ 67.56±1.43＊△濕潤(rùn)燒傷膏組 71.22±1.29＊△ 68.34±1.69＊△

2.2 八號(hào)膏對(duì)深Ⅱ度大鼠燙傷后3、14 d創(chuàng)面XOD活力的影響 燙傷后3 d創(chuàng)面XOD活力較正常組顯著上升，14 d后創(chuàng)面XOD活力下降，但仍高于正常組 (P＜0.05)。八號(hào)膏高、低劑量組各時(shí)間點(diǎn)XOD活力明顯低于模型組 (P＜0.05)，與正常組之間無(wú)顯著性差異 (P﹥0.05)，見(jiàn)表2。

表2 八號(hào)膏對(duì)深Ⅱ度大鼠燙傷創(chuàng)面XOD活力的影響(n=8，±s)Tab.2 Effect of Bahao Ointment on the wound XOD activity of deep partial-thickness burn rats(n=8，±s)

表2 八號(hào)膏對(duì)深Ⅱ度大鼠燙傷創(chuàng)面XOD活力的影響(n=8，±s)Tab.2 Effect of Bahao Ointment on the wound XOD activity of deep partial-thickness burn rats(n=8，±s)

組 別 XOD/(U·mgport－1)3 d 14 d正常組10.14 ±1.82 7.72 ±1.27模型組 20.08±2.71* 12.89±1.74*八號(hào)膏高劑量組 12.14±4.99△ 7.66±1.60△八號(hào)膏低劑量組 15.34±5.88△ 7.64+1.92△濕潤(rùn)燒傷膏 12.31±3.92△ 8.30+1.82△

2.3 八號(hào)膏對(duì)深I(lǐng)I度大鼠燙傷后3、14 d創(chuàng)面谷胱甘肽的影響 燙傷后3 d模型組創(chuàng)面谷胱甘肽含有量較正常組顯著降低，14 d后略有升高，但仍低于正常組 (P＜0.05)。八號(hào)膏高、低劑量組各時(shí)間點(diǎn)谷胱甘肽含有量明顯高于模型組，高劑量組各時(shí)間點(diǎn)谷胱甘肽含有量顯著高于正常組 (P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表3 八號(hào)膏對(duì)深Ⅱ度大鼠燙傷創(chuàng)面谷胱甘肽影響(n=8，±s)Tab.3 Effect of Bahao Ointment on the wound GSH content of deep partial-thickness burn rats(n=8，±s)

表3 八號(hào)膏對(duì)深Ⅱ度大鼠燙傷創(chuàng)面谷胱甘肽影響(n=8，±s)Tab.3 Effect of Bahao Ointment on the wound GSH content of deep partial-thickness burn rats(n=8，±s)

組 別 谷胱甘肽/(mg·mgprot－1)3 d 14 d正常組13.12 ±0.90 13.82 ±0.82模型組 6.21±1.55* 7.55±0.69*八號(hào)膏高劑量組 16.19±1.49＊△ 18.33±2.96△八號(hào)膏低劑量組 8.57±2.34△ 13.48±2.14△濕潤(rùn)燒傷膏 10.46±3.18△ 13.44±2.41△

2.4 八號(hào)膏對(duì)深Ⅱ度燙傷后3d大鼠血清IL-1β水平的影響 燙傷后3 d模型組血清IL-1β水平較正常組顯著上升，八號(hào)膏高、低劑量組濕潤(rùn)燒傷膏組IL-1β則明顯低于模型組 (P＜0.05)，見(jiàn)表4。

表4 八號(hào)膏對(duì)深Ⅱ度大鼠燙傷血清IL-1β影響(n=8，±s)Tab.4 Effect of Bahao Ointment on the serum IL-1β content of deep partial-thickness burn rats(n=8，±s)

表4 八號(hào)膏對(duì)深Ⅱ度大鼠燙傷血清IL-1β影響(n=8，±s)Tab.4 Effect of Bahao Ointment on the serum IL-1β content of deep partial-thickness burn rats(n=8，±s)

組 別 IL-1β/(pg·mL－1)正常組3.27 ±0.77模型組 7.24±1.31*八號(hào)膏高劑量組 4.43±0.37△八號(hào)膏低劑量組 4.61±0.58△濕潤(rùn)燒傷膏 4.99±1.10△

3 討論

八號(hào)膏是由大黃、五倍子、地榆、冰片等組成的特色中藥復(fù)方制劑，具有清熱解毒、活血化瘀、澀經(jīng)止血、生肌斂瘡之功效，臨床上適用于各種燒燙傷的治療。小面積深Ⅱ度度燙傷為臨床最為常見(jiàn)的燒傷類型，臨床上應(yīng)用八號(hào)膏治療此種類型的燙傷能有效減少創(chuàng)面滲出，加速創(chuàng)面的愈合，療效顯著。因此本研究選擇建立小面積深Ⅱ度大鼠燙傷模型來(lái)探討八號(hào)膏作用機(jī)制。同時(shí)深Ⅱ度燙傷后創(chuàng)面愈合主要分為兩個(gè)時(shí)期:炎癥反應(yīng)期 (2～4 d)和增殖修復(fù)期 (3～20 d)［4］。為了從不同時(shí)期研究八號(hào)膏對(duì)深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的治療作用，結(jié)合文獻(xiàn)選取了3 d和14 d作為研究時(shí)間點(diǎn)［4-5］。

中醫(yī)理論認(rèn)為燒燙傷是火毒所致。機(jī)體受熱力襲擊而致肌膚經(jīng)絡(luò)損傷，引起氣滯血瘀、津液輸布失常，進(jìn)而出現(xiàn)肌膚紅腫熱痛和滲出腫脹。這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)燒傷后炎癥反應(yīng)和創(chuàng)面微循環(huán)障礙的認(rèn)識(shí)相一致。皮膚燙傷后大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)創(chuàng)面，炎性細(xì)胞分泌大量炎性因子，致使創(chuàng)面發(fā)生過(guò)度的炎癥反應(yīng)。適度的炎癥反應(yīng)有利于清除創(chuàng)面感染，刺激血管再生，但過(guò)度的炎癥反應(yīng)是造成組織細(xì)胞壞死的主要因素，是創(chuàng)面早期加深擴(kuò)大的主要原因之一［6］。同時(shí)有報(bào)道指出過(guò)度的炎癥反應(yīng)可以激活基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMPs)，進(jìn)而加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解，阻礙創(chuàng)面的愈合。因此抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)能保護(hù)創(chuàng)面，促進(jìn)愈合［7］。

IL-1β主要由激活的單核巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞分泌。它能誘導(dǎo)炎性細(xì)胞分泌多種炎性因子、趨化因子，急性期蛋白等，進(jìn)而激活炎癥反應(yīng)，是炎性因子瀑布性釋放的核心因子。燒傷后抑制IL-1β能明顯減輕局部和全身炎癥反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面的愈合［8］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)燙傷后3 d模型組血清IL-1β仍高于正常水平，八號(hào)膏治療組IL-1β明顯降低。

燒傷后，局部創(chuàng)面微循環(huán)障礙，創(chuàng)面滲出增多，組織灌流量不足，處于缺血缺氧的狀態(tài)。黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為 XOD，進(jìn)而產(chǎn)生大量的 O2－和H2O2，是燒傷后活性氧 (ROS)的主要來(lái)源。另一方面燒傷后機(jī)體抗氧化能力下降，抗氧化物質(zhì)如谷胱甘肽耗竭，最終導(dǎo)致氧化平衡失調(diào)，氧化應(yīng)激發(fā)生。ROS可以引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，直接損傷細(xì)胞膜，導(dǎo)致膜功能障礙;細(xì)胞內(nèi)的ROS可以直接引起DNA斷裂，造成細(xì)胞死亡;ROS可以促進(jìn)TNF-α，IL-1β等多種炎性因子釋放，加重炎癥反應(yīng);ROS抑制角化細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的遷移和增殖，不利于細(xì)胞外基質(zhì)的合成;同時(shí)增強(qiáng)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的趨化性［9-11］。研究表明使用抗氧制劑如維生素E，維生素C等可以顯著地促進(jìn)創(chuàng)面愈合［12］。因此，燒傷后盡早進(jìn)行抗氧化治療可以更好地促進(jìn)創(chuàng)面愈合。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，燒傷后3 d創(chuàng)面XOD的活力顯著提高，14 d逐漸恢復(fù)。八號(hào)膏組XOD活力低于模型組，且兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明八號(hào)膏可以抑制燒傷后XOD的激活，降低XOD的活力，從而減少創(chuàng)面的ROS的產(chǎn)生。谷胱甘肽是保護(hù)蛋白中巰基和其他親核基團(tuán)免受ROS影響所必須的抗氧化物質(zhì)［13-14］。谷胱甘肽的濃度是反應(yīng)創(chuàng)面損傷程度的關(guān)鍵指標(biāo)之一［15］。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)燒傷后3 d模型組谷胱甘肽含有量顯著降低，14 d逐漸恢復(fù)。而八號(hào)膏則可以逆轉(zhuǎn)谷胱甘肽的降低，高劑量組谷胱甘肽含有量甚至高于正常組。

八號(hào)膏可以降低創(chuàng)面含水量、XOD活力，增加創(chuàng)面谷胱甘肽的含有量，同時(shí)降低血清炎性因子IL-1β的水平，提示八號(hào)膏可能通過(guò)抗炎抗氧化作用保護(hù)燙傷創(chuàng)面。

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