鐵皮石斛快繁及多糖含量測(cè)定

黃以平

（福州植物園，福建 福州350012）

鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimuraet Migo.為蘭科石斛屬，多年生草本植物，以新鮮或干燥莖入藥。為藥典收載且單獨(dú)列為一類的名貴中草藥之一，其性甘，微寒，歸胃、腎經(jīng)，功能益胃生津，滋陰清熱，用于陰傷津虧，口干煩渴，食少干嘔，病后虛熱，目暗不明等癥。多糖是其主要活性成分［1-2］，總多糖含量的高低是目前鐵皮石斛質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)［3-4］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行了組織培養(yǎng)，并參照2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》鐵皮石斛項(xiàng)下，測(cè)定了鐵皮石斛組培苗多糖的含量，初步分析鐵皮石斛組培苗的藥用價(jià)值，為鐵皮石斛優(yōu)良種質(zhì)資源的選育和資源開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥522AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；TU-1901新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；PL203型電子分析天平（METTLER TOLEDO上海公司）；SG5200 HPT型超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；80-2B型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SHBB95A型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；YB-2恒溫真空干燥箱（上海紐航儀器設(shè)備有限公司）；葡萄糖、苯酚、濃硫酸、石油醚、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、丙酮、正丁醇等試劑均為分析純。

1.2 鐵皮石斛組織培養(yǎng)

1.2.1 鐵皮石斛外植體增殖培養(yǎng) 取組培苗圃地中生長(zhǎng)的鐵皮石斛新鮮芽莖段，流水沖洗1 h，在超凈工作臺(tái)上用75%酒精處理1 min，再用0.1%升汞液浸泡12～15 min，倒去升汞液，用無(wú)菌水沖洗4～5次，每次不少于5 min，后用無(wú)菌紙吸干備用。將消毒好的莖段切除上下端各0.5cm后接種到培養(yǎng)基MS＋6-BA 2.0mg/L＋NAA 0.2mg/L＋蔗糖25g/L＋活性炭0.5g/L＋瓊脂10g/L（pH5.5～5.8）中誘導(dǎo)腋芽發(fā)生，培養(yǎng)溫度為25℃，光照12～16 h/d，1600 lx。約60 d后，轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基MS＋6-BA 4.0mg/L＋NAA 0.2mg/L＋蔗糖25g/L＋活性炭0.5g/L＋瓊脂10g/L（pH 5.8）中繼代培養(yǎng)，每5周1次，得未發(fā)根的組培苗。

1.2.2 鐵皮石斛生根培養(yǎng) 取增殖所得鐵皮石斛組培苗轉(zhuǎn)接至基本培養(yǎng)基1/2MS＋NAA 0.2mg/L＋香蕉泥100g/L＋蔗糖30g/L＋活性炭1g/L＋瓊脂10g/L（pH 5.8）中進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，光照12 h/d，2500 lx，得發(fā)根組培苗。

1.3 多糖含量測(cè)定［5］

1.3.1 供試樣品 采集至組培苗圃地生長(zhǎng)2年半、3年半的鐵皮石斛莖葉，本實(shí)驗(yàn)所得未發(fā)根組培苗莖葉和發(fā)根組培苗（發(fā)根組培苗完整植株，分為莖上、莖中、莖下和根部4部分）。將各樣品（其中未發(fā)根組培苗和發(fā)根組培苗不進(jìn)行煉苗，直接用于多糖含量測(cè)定）清洗干凈，干燥后，粉碎過(guò)3號(hào)篩，供測(cè)定多糖含量。

1.3.2 樣品溶液的制備 取樣品粉末約0.3g，精密稱定，加水200mL，加熱提取2 h，提取液轉(zhuǎn)移至250mL量瓶中，用適量水分次洗滌容器，洗液轉(zhuǎn)移至同一量瓶中；放冷，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液2mL，置15mL離心管中；精密加入無(wú)水乙醇10mL，搖勻，冷藏1 h，取出，離心（4000 rpm）20 min，棄去上清液，必要時(shí)濾過(guò)，沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8mL，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解并轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中；放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，即得樣品溶液。

1.3.3 對(duì)照品溶液的配制 取105℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，加水溶解并定量，搖勻，制成每1mL中含90 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

1.3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0.3mL，置于具塞比色管中，加蒸餾水至2.0mL，再加苯酚試液1.0mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0mL，迅速搖勻，放置5 min，置沸水浴中加熱15 min，取出，冷水迅速冷卻至室溫，作為供試溶液。在400～600 nm范圍對(duì)供試溶液進(jìn)行掃描。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置10mL具塞試管中，加水至1.0mL；精密加5%苯酚溶液1mL，搖勻，再精密加硫酸5mL，搖勻，置沸水浴中加熱20 min，取出，放入冰浴中冷卻5 min。以相應(yīng)的試劑為空白，按照紫外－可見(jiàn)分光光度法，在490 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y＝0.0742X－0.0008（r＝0.9980）。

1.3.6 樣品測(cè)定 精密量取樣品溶液1mL，置10mL具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1mL”起，依次測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品平行處理3份，取平均值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無(wú)水葡萄糖的量，代入回歸方程計(jì)算葡萄糖的質(zhì)量濃度，再按下式計(jì)算多糖的量：

多糖的量（%）＝CD/W×100%。

式中：C為供試液中葡萄糖的質(zhì)量濃度（mg/mL）；D為供試液的稀釋倍數(shù)；W為供試品量。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛增殖培養(yǎng)

2.1.1 外植體組織培養(yǎng) 將外植體接種至增殖培養(yǎng)基，其叢生芽的增殖率高，且生長(zhǎng)勢(shì)好，芽苗濃綠健壯?？蓪?duì)其芽苗進(jìn)行再增殖，建立快繁體系，30 d左右長(zhǎng)出完整莖葉。

2.1.2 鐵皮石斛發(fā)根 將增殖所得不帶根鐵皮石斛組培苗接種至1/2 MS培養(yǎng)基上，約20 d左右基部根開(kāi)始生長(zhǎng)，45 d左右苗生長(zhǎng)健壯、根系發(fā)達(dá)。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 最大檢測(cè)波長(zhǎng) 將葡萄糖及鐵皮石斛多糖溶液的顯色后溶液分別在400～600 nm內(nèi)掃描，結(jié)果在490 nm左右有最大吸收，故選擇490 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精取供試溶液5份，每份0.3mL，加蒸餾水使成2.0mL，各加苯酚試劑1.0mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線操作，重復(fù)5次，測(cè)定其吸光度，計(jì)算RSD值為1.03%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取鐵皮石斛粉末5份，每份1.0g，按樣品溶液制備和測(cè)定方法操作，分別測(cè)定其含量，結(jié)果計(jì)算RSD值為3.52%，重現(xiàn)性良好。

表1 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.4 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知鐵皮石斛粉末5份，分別精密加入不同量的對(duì)照品，蒸餾水定容，搖勻，重復(fù)測(cè)定5次，測(cè)定其吸光度并用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。測(cè)得平均回收率為99.11%，RSD值為1.01%。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝5）

2.2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精取供試溶液0.3mL，加蒸水使成2.0mL，加苯酚試劑1.0mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線操作，每隔30 min測(cè)定1次吸收度。測(cè)定結(jié)果為RSD＝0.92%，測(cè)定值在240 min內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 多糖含量的測(cè)定 精密量取鐵皮石斛各供試品溶液1.0mL，按“1.3.6”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度。同時(shí)精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液0.3mL，同法操作，按公式計(jì)算各樣品的多糖含量，結(jié)果見(jiàn)表4。鐵皮石斛發(fā)根組培苗的莖上、中、下3部分和根部多糖含量有較大差異，而未發(fā)根組培苗未檢測(cè)到多糖。其中發(fā)根組培苗各部位多糖含量各不同，多糖含量莖中＞莖上＞莖下＞根部，這與文獻(xiàn)［6］報(bào)道的基本一致。組培苗圃地生長(zhǎng)2年半、3年半的組培苗和發(fā)根組培苗的多糖含量分別為25.91%、26.80%和25.09%，可見(jiàn)，隨組培苗苗齡的增加，莖葉中多糖含量也隨之增加，且均達(dá)到藥典中鐵皮石斛多糖含量的規(guī)定。

表4 不同苗齡及部位的鐵皮石斛中多糖含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

3 討 論

我國(guó)鐵皮石斛種質(zhì)資源豐富，但由于自然和人為因素影響，野生鐵皮石斛種質(zhì)資源受到嚴(yán)重威脅。種苗的大量、快速生長(zhǎng)已成為規(guī)模化生產(chǎn)的關(guān)鍵，而組培快繁技術(shù)是解決該問(wèn)題的最好方法［7］，對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行增殖培養(yǎng)，在短時(shí)間內(nèi)可得到大量鐵皮石斛組培苗。2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定：鐵皮石斛按干燥品計(jì)算，含鐵皮石斛多糖以無(wú)水葡萄糖（C6H12O6）計(jì)，不得少于25.0%。本文利用苯酚-硫酸法測(cè)定了鐵皮石斛發(fā)根組培苗的多糖含量為25.09%，達(dá)到藥典鐵皮石斛多糖含量的規(guī)定，且隨組培苗苗齡的增加，莖葉中多糖含量也隨之增加，鐵皮石斛組培苗多糖的藥理作用有待于進(jìn)一步研究。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：265-266.

［2］諸燕，斯金平，郭寶林，等.人工栽培鐵皮石斛多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變異規(guī)律［J］.中國(guó)中藥雜志，2010，35（4）：427.

［3］陳蕤.石斛多糖提取工藝的研究［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，7（12）：40-43.

［4］劉宏源，楊金燕，黃松，等.3，5——二硝基水楊酸法測(cè)定鐵皮石斛中多糖的含量［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2010，6（8）：14-16.

［5］吳剛，季祥彪，康冀川，等.石斛中多糖和生物堿的含量測(cè)定［J］.山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2008，27（3）：274-278.

［6］華允芬，陳云龍，張銘.三種藥用石斛多糖成分的比較研究［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，38（2）：249-252.

［7］邵華，張玲琪，李俊梅.鐵皮石斛研究進(jìn)展［J］.中草藥，2004，35（1）：109-202.