導(dǎo)數(shù)同步熒光法測(cè)定鴨蛋蛋清中金霉素殘留含量

袁海超，趙進(jìn)輝，2，劉木華*，肖海斌，徐 將

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院/生物光電及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 南方農(nóng)業(yè)機(jī)械與裝備關(guān)鍵技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

鴨蛋蛋清中殘留的抗生素含量的快速測(cè)定對(duì)評(píng)價(jià)鴨蛋內(nèi)部品質(zhì)有著重要意義。金霉素等四環(huán)素類抗生素是殘留在鴨蛋中常見(jiàn)的抗生素，人們長(zhǎng)期食用含有抗生素的鴨蛋后可能會(huì)對(duì)人體造成致癌、致畸、致突變、過(guò)敏和變態(tài)反應(yīng)、毒性作用、影響人體的激素平衡等危害。目前，鴨蛋中的抗生素的常規(guī)測(cè)定方法有理化檢測(cè)方法[1－2]、微生物法[3－4]、酶聯(lián)免疫分析法[5－6]等，這些方法雖然檢測(cè)精度較高，但需要進(jìn)行復(fù)雜的前處理，且檢測(cè)耗時(shí)，操作復(fù)雜，不能滿足鴨蛋中金霉素含量的綠色快速檢測(cè)要求。因此，有必要探索一種綠色快速的鴨蛋中抗生素檢測(cè)方法。

導(dǎo)數(shù)同步熒光法不僅可以減小背景干擾和譜帶重疊，而且更有利于減小散射干擾和光譜重疊現(xiàn)象，是一種高選擇性與高靈敏度的混合物分析方法[7－8]。基于熒光光譜的優(yōu)越性，已有學(xué)者對(duì)鰻魚組織中三種喹諾酮藥物殘留[9]、豬肉中的螺旋霉素[10]與強(qiáng)力霉素[11]殘留等進(jìn)行了研究。但從目前查閱的文獻(xiàn)來(lái)看，對(duì)物體內(nèi)的抗生素殘留主要是先對(duì)提取液進(jìn)行熒光檢測(cè)，然后建立最佳波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度與抗生素濃度之間的關(guān)系。實(shí)際上生物組織的多樣性和復(fù)雜性，有必要對(duì)完整的熒光光譜信息進(jìn)行提取和分析，從中得到有用的熒光光譜特征信息，進(jìn)而建立預(yù)測(cè)模型。鑒于此，本研究對(duì)完整的熒光光譜信息進(jìn)行分析與處理，先用聯(lián)合區(qū)間偏最小二乘法(siPLS)優(yōu)選一階導(dǎo)數(shù)熒光光譜特征子區(qū)間，然后用遺傳算法(GA)在特征子區(qū)間內(nèi)提取特征波長(zhǎng)，在此基礎(chǔ)上建立鴨蛋蛋清中金霉素殘留的一階導(dǎo)數(shù)熒光光譜的預(yù)測(cè)模型，嘗試建立一種鴨蛋蛋清中金霉素殘留含量的綠色快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

鴨蛋(購(gòu)于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)市場(chǎng));鹽酸金霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度約90%，購(gòu)于中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng));NaOH為分析純;水為超純水。

1.2 儀器設(shè)備

Cary Eclipase熒光分光光度計(jì)(Varian，Inc.，USA);FA1004B型電子天平(精度為0.1 mg，上海上平儀器有限公司);JK－50B型超聲波清洗器(合肥金尼克機(jī)械有限公司);HH－6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海浦東物理光學(xué)儀器廠);石英比色皿(光程為1 cm)。

1.3 試驗(yàn)方法

(1)在鴨蛋殼上開(kāi)個(gè)小口，讓蛋清慢慢流入燒杯中，然后用玻璃棒將蛋清攪拌均勻作為緩沖液備用;(2)稱取10.0 mg金霉素標(biāo)準(zhǔn)品，以超純水稀釋定容至100 mL，超聲溶解，配制成100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;(3)分別取不同體積金霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液于棕色容量瓶中，加入0.1 mol/L NaOH溶液1 mL，在沸水浴中反應(yīng)45 min后，用鴨蛋蛋清緩沖液稀釋定容至刻度，搖勻，得到60個(gè)樣本，其中48個(gè)作為校正樣本，12個(gè)作為預(yù)測(cè)樣本，樣本中的金霉素含量統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。(4)將不同金霉素含量的樣本置入石英比色皿中，利用Cary Eclipase熒光分光光度計(jì)分別采集其同步熒光光譜。同步熒光光譜采集參數(shù)設(shè)置為:波長(zhǎng)差△λ為70 nm，PMT探測(cè)器電壓為700 V，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為2.5 nm，Emission filter參數(shù)設(shè)置為360～1 100 nm，平滑方式為Moving Average，中等掃描速度，在280～400 nm內(nèi)同步掃描。

表1 樣本中的金霉素含量統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.1 Statistical results of aureomycin content of samples

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究使用MATLAB R2007b進(jìn)行相關(guān)的數(shù)據(jù)分析。先將同步熒光光譜進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)處理，然后用siPLS－GA法進(jìn)行特征波長(zhǎng)的提取，最后應(yīng)用SVM_SteveGunn工具箱建立鴨蛋蛋清中金霉素殘留含量的定量測(cè)定模型。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 三維同步熒光指紋圖譜

圖1 樣本的三維同步熒光等高線光譜圖Fig.1 Contour spectrum diagram of three-dimensional synchronous fluorescence of samples

按照試驗(yàn)方法，對(duì)鴨蛋蛋清(空白樣本)、金霉素標(biāo)準(zhǔn)品和含金霉素的鴨蛋蛋清樣本進(jìn)行三維同步熒光光譜掃描，其中波長(zhǎng)差△λ 為40，50，60，70，80，90，100，110，120 nm，得到的三維同步熒光等高線光譜圖如圖1所示。從圖1(a)可以看出，在Ex=309.07 nm/△λ=60 nm附近具有一個(gè)最佳的鴨蛋蛋清特征熒光峰;從圖1b可以看出，在Ex=344 nm/△λ=70 nm附近具有一個(gè)最佳的金霉素特征熒光峰;從圖1c可以看出，鴨蛋蛋清與金霉素的特征熒光峰的位置分別發(fā)生了幾個(gè)nm偏移，但圖1a中的鴨蛋蛋清同步熒光指紋和圖1b中的金霉素同步熒光指紋在圖1c中得到了較好的重現(xiàn)，且兩者的熒光峰得到了較好的分離。因此，根據(jù)鴨蛋蛋清與金霉素各自的三維同步熒光指紋特性，可分辨出鴨蛋蛋清與金霉素的波峰及其種類。

2.2 同步熒光波長(zhǎng)差△λ的選擇

為了選擇合適的波長(zhǎng)差△λ，測(cè)定了含金霉素的鴨蛋蛋清的三維同步熒光光譜，其中波長(zhǎng)差△λ為40，50，60，70，80，90，100，110，120 nm，樣本的示例圖如圖2所示。從圖2可以看出，隨著△λ增加，鴨蛋蛋清背景峰與金霉素的同步熒光強(qiáng)度都是呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，鴨蛋蛋清在△λ=60時(shí)最強(qiáng)，金霉素在△λ=70 nm時(shí)最強(qiáng)?？紤]到對(duì)金霉素檢測(cè)的靈敏度，綜合分析，本研究選擇△λ=70 nm進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)研究。

圖2 含有金霉素的鴨蛋蛋清的三維同步熒光光譜圖Fig.2 Three-dimensional synchronous fluorescence spectroscopy of duck egg white with aureomycin

2.3 同步熒光光譜的一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理

雖然同步熒光光譜能夠較好的解決鴨蛋蛋清與金霉素的光譜重疊現(xiàn)象，但是導(dǎo)數(shù)技術(shù)與同步熒光光譜相結(jié)合，能更好地解決背景干擾和譜帶重疊問(wèn)題[8]。因此，本研究采用了Savitizky Golay對(duì)同步熒光光譜進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理，其中:窗口參數(shù)為5，擬合次數(shù)為2。經(jīng)過(guò)一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理后的光譜如圖3所示。

2.4 siPLS選擇特征光譜區(qū)間

含金霉素的鴨蛋蛋清的一階導(dǎo)數(shù)同步熒光的全光譜波長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)為121，若不加篩選而直接用于模型預(yù)測(cè)，導(dǎo)致的后果可能是不僅會(huì)影響模型的預(yù)測(cè)速度，而且一些無(wú)用波長(zhǎng)會(huì)對(duì)模型的預(yù)測(cè)精度產(chǎn)生不良影響，不利于快速檢測(cè)。因此，本研究先用siPLS優(yōu)選一階導(dǎo)數(shù)熒光光譜特征子區(qū)間，然后用GA在特征子區(qū)間內(nèi)提取特征波長(zhǎng)。試驗(yàn)將整個(gè)一階導(dǎo)數(shù)同步熒光光譜分別劃分為 10、11、12、13、…、24、25個(gè)子區(qū)間，通過(guò)交互驗(yàn)證法優(yōu)化被劃分的區(qū)間數(shù)與聯(lián)合子區(qū)間，聯(lián)合子區(qū)間數(shù)取值范圍為2～4，以考察不同數(shù)目的子區(qū)間劃分與聯(lián)合子區(qū)間數(shù)對(duì)模型性能以及最佳波長(zhǎng)區(qū)間的影響。表2為基于siPLS的特征光譜區(qū)間選擇結(jié)果。

依據(jù)交互驗(yàn)證均方根誤差(RMSECV)選擇導(dǎo)數(shù)同步熒光的特征光譜區(qū)間。由表2可以看出，當(dāng)整個(gè)導(dǎo)數(shù)同步熒光光譜區(qū)域被劃分為23個(gè)子區(qū)間(前6個(gè)子區(qū)間每個(gè)子區(qū)間有6個(gè)波長(zhǎng)，后17個(gè)子區(qū)間每個(gè)子區(qū)間有5個(gè)波長(zhǎng))，主成分因子數(shù)為10，聯(lián)合子區(qū)間為[5 11 14 16]時(shí)，為本研究應(yīng)用siPLS優(yōu)選特征光譜區(qū)間結(jié)果。圖3給出了基于siPLS的最佳特征光譜子區(qū)間組合，圖中黑色條帶區(qū)表示被選中的4個(gè)特征光譜子區(qū)間，共21個(gè)特征波長(zhǎng)，各子區(qū)間對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)范圍分別為:304.0～309.1 nm，336.0～340.0 nm，351.1 ～355.1 nm 和361.1 ～365.1 nm。

圖3 基于siPLS選擇的最佳特征光譜區(qū)間選擇結(jié)果Fig.3 Results of characteristic spectral regions selected by siPLS

表2 基于siPLS的特征光譜區(qū)間選擇結(jié)果Tab.2 Results of feature spectral regions selected by siPLS method

2.5 GA提取特征波長(zhǎng)

在被選中的[5 11 14 16]這4個(gè)特征光譜子區(qū)間的基礎(chǔ)上，繼續(xù)用GA進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)同步熒光特征波長(zhǎng)提取。此時(shí)GA的相關(guān)參數(shù)設(shè)定為:初始群體為30，交叉概率為0.5，變異概率為0.01，以RMSECV值構(gòu)造GA算法的適應(yīng)度函數(shù)，當(dāng)?shù)?00次時(shí)本次迭代終止。圖4為所有21個(gè)變量按選取頻率重新排列后，RMSECV值隨選取變量數(shù)的逐步增加而變化的趨勢(shì)圖。由圖4可以看出，最佳的變量數(shù)為11時(shí)，所對(duì)應(yīng)的RMSECV值最低為1.195 7。因此，這11個(gè)變量即為GA法所優(yōu)選的特征波長(zhǎng)。

圖4 不同變量數(shù)與RMSECV的對(duì)應(yīng)關(guān)系圖Fig.4 RMSECV as a function of the number of variables included

圖5 鴨蛋蛋清中金霉素含量測(cè)定中預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間的關(guān)系Fig.5 Relationship between actual value and predictive value of aureomycin contents in Duck Egg White

2.6 模型的預(yù)測(cè)結(jié)果與討論

針對(duì)支持向量回歸(SVR)在解決非線性問(wèn)題與小樣本統(tǒng)計(jì)問(wèn)題方面的優(yōu)勢(shì)[12]，本研究選擇采用 SVM_Steve-Gunn工具箱中的Regression_SVM_SteveGunn.m文件來(lái)建立SVR預(yù)測(cè)模型，并以徑向基函數(shù)作為SVR的核函數(shù)。表3給出了不同條件下應(yīng)用Regression_SVM_SteveGunn.m文件建立模型的預(yù)測(cè)結(jié)果，從表3可以看出，在原始全光譜范圍內(nèi)建立的模型預(yù)測(cè)效果最差，一階導(dǎo)數(shù)全光譜建立的模型預(yù)測(cè)效果次之，以siPLS－GA選擇波長(zhǎng)建立的預(yù)測(cè)模型效果最好。這說(shuō)明對(duì)原始光譜進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)處理后較好的解決了背景干擾和譜帶重疊等問(wèn)題，而siPLS－GA法進(jìn)一步從一階導(dǎo)數(shù)同步熒光光譜中剔除了一些次要波長(zhǎng)，有益于提高本研究的預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)精度和速度。圖5給出了以siPLS－GA優(yōu)選的波長(zhǎng)作為輸入建立的預(yù)測(cè)模型的鴨蛋蛋清中金霉素殘留含量的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間的關(guān)系，其預(yù)測(cè)集的決定系數(shù)和預(yù)測(cè)均方根誤差分別為0.973和1.501 1 mg/L，能夠滿足鴨蛋蛋清中金霉素殘留含量快速測(cè)定要求。

表3 不同條件下的模型的預(yù)測(cè)結(jié)果比較Tab.3 Result and comparison of models in different conditions

3 結(jié)論

本研究探討了利用一階導(dǎo)數(shù)同步熒光光譜結(jié)合siPLS、GA、SVR來(lái)建立鴨蛋蛋清中金霉素殘留含量的綠色快速測(cè)定方法。先根據(jù)三維同步熒光光譜優(yōu)選出檢測(cè)鴨蛋蛋清中的金霉素含量的最佳波長(zhǎng)差△λ為70 nm，然后對(duì)原始同步熒光光譜進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理，并用siPLS優(yōu)選了4個(gè)特征光譜子區(qū)間，即[5 11 14 16]，在這4個(gè)特征光譜子區(qū)間內(nèi)繼續(xù)用GA優(yōu)選出11個(gè)特征波長(zhǎng)，最后用SVM_SteveGunn工具箱建立了基于SVR的預(yù)測(cè)模型，預(yù)測(cè)集的決定系數(shù)和預(yù)測(cè)均方根誤差分別為0.973和1.501 1 mg/L。研究結(jié)果表明，本文研究方法用于鴨蛋蛋清中金霉素殘留含量的綠色快速測(cè)定是可行的。

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