白藜蘆醇對膽固醇酯水解酶的調(diào)節(jié)作用

張鳳香，賀成業(yè), 關(guān) 寧，李晨光，羅俊生

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 心外科，遼寧錦州 121001

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)嚴(yán)重危害人類健康，引發(fā)心腦血管疾病，是一種常見和多發(fā)的疾病，其發(fā)病率和病死率均較高。因此，預(yù)防和控制AS疾病是亟待解決的問題。白藜蘆醇(resveratrol)是一種非黃酮類多酚化合物，存在于葡萄科、百合科、豆科等多種植物中[1]。大量研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇具有保護(hù)心血管、抗腫瘤、抗炎癥和抗氧化等多方面作用；白藜蘆醇經(jīng)口服后能迅速被人體吸收、分布和代謝[2-3]。我們前期研究已初步探明白藜蘆醇能通過增強膽固醇酯水解酶(carboxylic ester hydrolase，CEH)的表達(dá)抑制泡沫細(xì)胞形成，并且促進(jìn)膽固醇外流。本研究是在此基礎(chǔ)上用動物實驗進(jìn)一步驗證白藜蘆醇是否可通過影響CEH表達(dá)預(yù)防動脈粥樣硬化形成。

材料和方法

1 實驗動物及材料 ApoE-/-小鼠雄性40只，8周齡，購自北京維通利華有限公司(動物許可證編號SCXK京2006-0004)。飼養(yǎng)于符合二級動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的遼寧醫(yī)學(xué)院動物研究所。白藜蘆醇購自Sigma公司；補體因子H(complement factor H，CFH)多克隆抗體、VCAM-1多克隆抗體、鼠抗β-actin一抗、二抗均購自美國Abcam公司；DAB顯色試劑盒購自碧云天公司；CEH的基因序列由QIAGEN公司設(shè)計；CEH siRNA的序列：CEH siRNA正義鏈5'-UCAGGACUUGGCUGAACUUU-3'；反義鏈5'-AGA UAGCCAAGUCGGCGACA-3'。

2 分組 將動物模型分為四組，每組10只。白藜蘆醇組：100 μg/kg小鼠腹腔注射，每周2次，高脂飲食，共10周。CEH siRNA組：100 μl/100 μl PBS腹腔注射，每周2次，高脂飲食，共10周。白藜蘆醇+CEH siRNA組：依上述條件腹腔注射，每周2次，高脂飲食，共10周。對照組：不進(jìn)行任何干預(yù)，高脂飲食10周。

3 血脂水平檢測 血液從腹主動脈收集于肝素抗凝管，離心3 000 r/min，10 min。而后血漿在-80 ℃冰箱內(nèi)保存。采用全自動生化分析儀及血生化測定試劑盒，檢測總TC、TG、HDL-C含量和LDL-C含量，所有操作步驟按儀器說明書進(jìn)行。單位以mmol/L表示。

4 病理觀察 將4%多聚甲醛固定后的主動脈切成3~4 mm長度組織塊，冰凍包埋。冰凍包埋：用OCT包埋組織，錫紙包裹，放-40 ℃冰箱中備用。將包埋的組織蠟塊分別連續(xù)切片，切片厚5 μm，于60 ℃烤片機烤2 h，然后分別用于油紅O染色、HE染色，光鏡下觀察各組主動脈內(nèi)膜、中膜的病變，CMIA彩色病理圖像分析系統(tǒng)計算其厚度。

5 qRT-PCR檢測CFH及VCAM-1的表達(dá) 具體步驟參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件如下 ：95 ℃ 15 min ；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃2 min，共30個循環(huán)。取10 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。qRT-PCR法檢測CFH的表達(dá)，上游引物為：5'-GCACTTGGATCCACCCAGAA-3'，下游引物為：5'-GAAGTTGTCAAAGATGGTGCCAG A-3'。VCAM-1的表達(dá)上游引物為：5'-CTGCTCAC CCAACATTTCGT-3'，下游引物為：5'-GTGGTTTGT CCAAACTCATCAA-3'。內(nèi)參β-actin的上游引物為：5'-ACCCTGAAGTACCCCATCG-3'，下游引物為：5'-TAGCACAGCCTGGATAGCAA-3'。

6 Western blot檢測CFH及VCAM-1的表達(dá) 用pH 7.4 含 50 mmol/L Tris-HCl、0.15 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、0.1% Triton X-100和0.1%十二烷基硫酸鈉的蛋白裂解液提取胸主動脈的總蛋白，蛋白濃度參照BCA試劑盒測定。煮沸變性的蛋白以每孔40 μg的含量加樣，經(jīng)濃縮膠6%，分離膠10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離。通過電轉(zhuǎn)儀將凝膠上的蛋白樣品轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉在37 ℃封閉2 h。分別與1∶300兔抗人CFH，1∶2 000鼠抗人VCAM-1抗體4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶500)羊抗兔IgG(1∶500)，4 ℃孵育2 h。洗膜3次，每次10 min。ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，凝膠成像。

7 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所得結(jié)果用-x±s表示，采用ANOVA分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 白藜蘆醇與CEH對ApoE-/-小鼠血脂的影響白藜蘆醇+CEH siRNA和白藜蘆醇組TC和TG均略有降低，而HDL-C略有升高；CEH siRNA組TC和TG均略有升高，而HDL-C略有降低。但與對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異；白藜蘆醇組LDL-C與對照組相比下降(P＜0.05)，白藜蘆醇組LDL-C與白藜蘆醇+CEH siRNA組相比下降(P＜0.05)，而CEH siRNA組LDL-C與對照組相比升高(P＜0.05)說明白藜蘆醇可能通過CEH影響LDL-C的形成，見表1。

表1 各組間血脂各項指標(biāo)比較(mmol/L,

表1 各組間血脂各項指標(biāo)比較(mmol/L,

aP＜0.05，與對照組比較；bP＜0.05，與白藜蘆醇+CEH siRNA組比較

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2 主動脈內(nèi)膜厚度比較 光鏡下發(fā)現(xiàn)，對照組主動脈內(nèi)膜明顯增厚，斑塊內(nèi)可見大量泡沫細(xì)胞，斑塊下中膜也呈不同程度破壞；白藜蘆醇組主動脈內(nèi)膜輕度增厚，斑塊內(nèi)僅見少量泡沫細(xì)胞，與空白對照組和白藜蘆醇+CEH siRNA組相比明顯減輕(P＜0.01)，與空白對照組和白藜蘆醇+CEH siRNA組相比中膜增厚不明顯(P＜0.01)；而CEH siRNA組內(nèi)膜增厚，泡沫細(xì)胞與空白對照組相比明顯增多(P＜0.01)，中膜增厚，與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 主動脈內(nèi)膜、中膜厚度比較(μm,

表2 主動脈內(nèi)膜、中膜厚度比較(μm,

aP＜0.01，與對照組比較；bP＜0.01，與白藜蘆醇+CEH siRNA組比較

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3 白藜蘆醇與CEH對VCAM-1表達(dá)的影響 qRTPCR和Western Blot檢測發(fā)現(xiàn):白藜蘆醇組VCAM-1的表達(dá)和對照組比較降低；CEH siRNA組VCAM-1的表達(dá)與對照組比較增加。見圖1。

4 白藜蘆醇與CEH對CFH表達(dá)的影響 qRT-PCR和Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)；白藜蘆醇組小鼠CFH的表達(dá)與對照組比較增強；CEH siRNA組小鼠CFH的表達(dá)與對照組比較降低。見圖2。

討 論

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性血管疾病，嚴(yán)重威脅人類健康。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CEH可以水解細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯(cholesteryl esters，CEs)使其成為游離膽固醇(free cholesterol，F(xiàn)C)，以促進(jìn)膽固醇流出細(xì)胞，從而降低細(xì)胞中CEs的蓄積，保持細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的穩(wěn)定，抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化[4]。有研究報道，CEH的表達(dá)水平與動脈粥樣硬化的易感性密切相關(guān)，兩者之間呈負(fù)相關(guān)[5]。

白藜蘆醇及其衍生物近年來受到廣泛重視，其抗動脈粥樣硬化作用也逐漸成為研究熱點，本實驗是在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究白藜蘆醇與CEH之間的關(guān)系。本研究采用ApoE-/-小鼠構(gòu)建動物模型，我們對ApoE-/-小鼠予以高脂飼料喂養(yǎng)同時加白藜蘆醇和(或)CEH siRNA干預(yù)10周后，檢測各組小鼠的各項血脂指標(biāo)，本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，白藜蘆醇組LDL-C明顯下降，主動脈內(nèi)膜輕度增厚，斑塊內(nèi)僅見少量泡沫細(xì)胞，中膜增厚不明顯；CEH siRNA組LDL-C明顯升高，內(nèi)膜增厚，泡沫細(xì)胞明顯增多，中膜增厚明顯；TC、TG、HDL-C水平與對照組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。該結(jié)果說明白藜蘆醇可以通過CEH影響機體內(nèi)血脂水平，從而影響動脈粥樣斑塊的形成。

補體在AS形成過程中起著非常重要的作用。CFH是旁路途徑的抑制因子，它可與B因子競爭性結(jié)合C3，減少C3轉(zhuǎn)化酶的形成，使分解產(chǎn)物減少，從而達(dá)到降低動脈粥樣硬化斑塊形成的目的。細(xì)胞黏附是始動及加速AS發(fā)生、發(fā)展的分子基礎(chǔ)，其中血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)在介導(dǎo)單核細(xì)胞向內(nèi)皮黏附、遷移過程中起到極其重要的作用。當(dāng)血管內(nèi)皮受損時，機體高表達(dá)VCAM-1，促使單核細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生粘連，進(jìn)而加速動脈粥樣斑塊的形成。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇組CFH的表達(dá)明顯強于對照組，而VCAM-1的表達(dá)明顯低于對照組；CEH siRNA組CFH的表達(dá)明顯弱于對照組，但VCAM-1的表達(dá)卻明顯強于對照組。該研究結(jié)果的發(fā)現(xiàn)證明白藜蘆醇可以通過CEH影響動脈粥樣硬化相關(guān)因子的表達(dá)，進(jìn)一步說明白藜蘆醇與CEH在預(yù)防動脈粥樣斑塊形成過程中存在著某種聯(lián)系。綜上，該研究結(jié)果的發(fā)現(xiàn)可能為動脈粥樣硬化斑塊防治提供新的思路。

圖1 A： Western Blot； B：qRT-PCR(aP＜0.05， 與對照組比較)

圖2 A； Western Blot結(jié)果；B：qRT-PCR結(jié)果(aP＜0.05， 與對照組比較)

1 Pervaiz S. Resveratrol： from grapevines to mammalian biology［J］.FASEB J， 2003， 17（14）： 1975-1985.

2 Sadruddin S， Arora R. Resveratrol： biologic and therapeutic implications［J］. J Cardiometab Syndr， 2009， 4（2）： 102-106.

3 Bishayee A. Cancer prevention and treatment with resveratrol： from rodent studies to clinical trials［J］. Cancer Prev Res （Phila），2009， 2（5）： 409-418.

4 Zhao B， Fisher BJ， St Clair RW， et al. Redistribution of macrophage cholesteryl ester hydrolase from cytoplasm to lipid droplets upon lipid loading［J］. J Lipid Res， 2005， 46（10）：2114-2121.

5 Rothblat GH， de la Llera-Moya M， Favari E， et al. Cellular cholesterol flux studies： methodological considerations［J］.Atherosclerosis， 2002， 163（1）：1-8.