低氧濃度與常規(guī)氧濃度對(duì)胚胎早期發(fā)育及妊娠結(jié)局的影響

牛子儒，馬慜悅，岳曉靜，張士慧，陸翀曌，王 輝，舒軍萍，彭紅梅，姚元慶

解放軍總醫(yī)院 婦產(chǎn)科生殖中心，北京 100853

隨著輔助生育技術(shù)的發(fā)展，多種胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)正在臨床應(yīng)用，其中培養(yǎng)箱氧氣濃度在各個(gè)中心應(yīng)用有所不同。一些研究顯示在小鼠，牛和豬等哺乳動(dòng)物的胚胎培養(yǎng)中，降低培養(yǎng)箱內(nèi)混合氣體的氧氣濃度對(duì)胚胎發(fā)育有一定好處[1-8]。在一些哺乳動(dòng)物中已經(jīng)觀察到子宮內(nèi)的氧濃度低于輸卵管內(nèi)的氧濃度。恒河猴輸卵管內(nèi)的氧濃度是5%~8.7%，而在其子宮內(nèi)的氧濃度只有約2%[9]。因此，可以認(rèn)為當(dāng)胚胎到達(dá)子宮時(shí)是暴露于一個(gè)低氧的環(huán)境，同時(shí)這也是囊胚形成和植入的時(shí)段。有研究指出人類胚胎體外培養(yǎng)在3~5 d時(shí)降低氧濃度與在1~5 d時(shí)降低氧濃度可以提高相似的卵裂率和妊娠率，提示低氧濃度對(duì)8細(xì)胞期囊胚更為重要，并與有關(guān)子宮內(nèi)氧濃度較輸卵管內(nèi)低的研究相一致[9-10]。在人類輔助生殖周期中，傳統(tǒng)胚胎培養(yǎng)箱采用大氣中的氧濃度(約20%)，有研究提出過(guò)高的氧濃度可能產(chǎn)生對(duì)胚胎有害的物質(zhì)如氧自由基[11-12]。但有關(guān)人類胚胎培養(yǎng)氧濃度影響的研究結(jié)果并不一致。有些研究顯示降低氧濃度(5%)未能顯著提高胚胎的質(zhì)量、著床率和妊娠率。但也有研究顯示低氧濃度可以提高臨床妊娠率和出生率[13-17]。本研究通過(guò)評(píng)估常規(guī)氧濃度(20%)與低氧濃度(5%)對(duì)人類胚胎在受精后第1天到第3天的影響，比較兩組胚胎發(fā)育和妊娠情況。

資料和方法

1 對(duì)象 經(jīng)患者知情同意后，收集本中心2012年3-11月接受體外受精(in vitro fertiliza-tion，IVF)或卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的周期病例。獲得的受精卵分配到常規(guī)氧濃度(20%)或低氧濃度(5%)兩個(gè)培養(yǎng)箱中。ICSI主要應(yīng)用在男性因素所致的不孕(精子密度＜3×106/ml，畸形率＞95%及a+b級(jí)精子活力＜50%)和前次IVF受精率低或自然受精障礙的周期。其他周期采用常規(guī)IVF方案。排除行附睪/睪丸穿刺活檢-單精子授精(PESA/TESA)及胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)等的周期病例。

2 周期方案 所有周期均根據(jù)患者反應(yīng)情況采用本中心常規(guī)超促排卵方案，GnRH激動(dòng)劑與促性腺素 (human menopausal gonadotropin，HMG)相結(jié)合刺激卵泡發(fā)育。超聲監(jiān)測(cè)卵泡生長(zhǎng)情況，并與激素測(cè)定相結(jié)合確定取卵時(shí)機(jī)，給予5 000 IU人絨毛膜促性腺素促排，肌注36 h后陰道超聲引導(dǎo)下取卵，約5 h后進(jìn)行人工授精或單精子注射。在第3天根據(jù)胚胎發(fā)育情況、形態(tài)、患者年齡、取卵數(shù)及其他情況確定是否新鮮移植及移植胚胎數(shù)目。對(duì)剩余形態(tài)學(xué)評(píng)分較高的胚胎冷凍保存。解凍移植的周期根據(jù)其自身情況采用自然或人工周期，同樣移植2個(gè)或3個(gè)解凍胚胎。根據(jù)胚胎透明帶厚度和患者年齡等情況決定是否進(jìn)行輔助孵化。

3 胚胎培養(yǎng) 卵子和胚胎在覆蓋礦物油(Vitrolife Ovoil)的50 μl和20 μl的培養(yǎng)液(Vitrolife G系列)小滴中培養(yǎng)。采用Therom公司的培養(yǎng)箱，常規(guī)氧濃度組(20%)采用5%的二氧化碳和空氣進(jìn)行氧濃度控制；低氧濃度組(5%)采用5%的二氧化碳、90%的氮?dú)夂涂諝膺M(jìn)行氧濃度的控制。每天對(duì)兩個(gè)培養(yǎng)箱的氣體濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)并在必要時(shí)校正。在受精18~20 h后，以是否出現(xiàn)原核來(lái)判斷卵子的受精情況[18]。

4 胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分 在受精后第2、3天，根據(jù)每一個(gè)胚胎的卵裂球數(shù)目、大小和碎片等情況進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)分。Ⅰ級(jí)，胚胎卵裂球均勻規(guī)則，胞質(zhì)均質(zhì)透明，透明帶完整，胚胎無(wú)或僅有極少(＜5%)碎片；Ⅱ級(jí)，卵裂球形態(tài)輕度不均勻，胞漿折光性有輕微變化，碎片＜10%，透明帶完整；Ⅲ級(jí)，胚胎內(nèi)碎片＜20%，其余卵裂球形態(tài)同Ⅱ級(jí)，透明帶完整；Ⅳ級(jí)，胚胎內(nèi)碎片＞20%，碎片外卵裂球具有活細(xì)胞特征，胞漿折光性有較大改變，胞漿變黑、顆粒不均勻[19]。

5 評(píng)價(jià)指標(biāo) 1)胚胎發(fā)育情況：包括正常受精率(正常受精數(shù)目/MⅡ數(shù)目)，多精受精率(多精受精數(shù)目/MⅡ數(shù)目)，卵裂率(卵裂數(shù)目/受精數(shù)目)，優(yōu)質(zhì)胚胎率(胚胎評(píng)分1或2的數(shù)目/所有胚胎數(shù)目)；2)妊娠結(jié)局包括：生化妊娠率和臨床妊娠率。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 兩組患者基本情況比較Tab.1 Basic parameters of patients in two groups

表2 兩組胚胎發(fā)育與妊娠結(jié)局比較Tab.2 Embryo development and pregnancy outcome in two groups(%)

結(jié) 果

1 一般資料 共195例周期進(jìn)入研究，低氧濃度組為101例周期，常規(guī)氧濃度組為94例周期。兩組間一般特征如男女方年齡、不孕年限、IVF/ICSI方案、獲卵數(shù)及周期移植胚胎數(shù)等資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2 不同氧濃度對(duì)胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局的影響 兩組多精受精率，D1卵裂率，D2、D3優(yōu)胚率比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。兩組新鮮移植率，胚胎冷凍率，解凍移植率比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。兩組新鮮移植周期妊娠率，低氧濃度組高于正常氧濃度組(χ2=3.963，P＜0.05)。解凍移植周期妊娠率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

討 論

本研究評(píng)價(jià)了在胚胎培養(yǎng)混合氣體中降低氧濃度對(duì)胚胎發(fā)育和IVF/ICSI結(jié)局的影響，遺憾的是與常規(guī)氧濃度相比，未發(fā)現(xiàn)低氧濃度對(duì)胚胎質(zhì)量、早期發(fā)育等有明顯益處。但在新鮮移植周期的妊娠率比較中，低氧濃度組的妊娠率高于正常氧濃度組，可以認(rèn)為經(jīng)低氧濃度培養(yǎng)的胚胎更利于著床。但解凍周期的胚胎移植妊娠結(jié)局未發(fā)現(xiàn)兩組有明顯差異。

體內(nèi)胚胎一直暴露于低氧環(huán)境中，從未暴露于20%的氧濃度環(huán)境，而這一氧環(huán)境被很多學(xué)者認(rèn)為可以產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，ROS包括超氧陰離子基團(tuán)(O2-)，過(guò)氧化氫(H2O2)和羥自由基(OH)[9,12]。過(guò)高的ROS可以導(dǎo)致DNA損傷、線粒體改變、脂質(zhì)過(guò)氧化或蛋白質(zhì)的氧化改變等[11-12,20]。有研究顯示高氧環(huán)境可以改變胚胎的發(fā)育潛能[21]。在一些動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)了高氧環(huán)境的不利影響，如在大鼠試驗(yàn)中，低氧與高氧培養(yǎng)的胚胎桑葚胚和囊胚的發(fā)生率及形態(tài)學(xué)雖然無(wú)差異，但低氧培養(yǎng)的胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)目和著床率顯著高于正常氧濃度組[2]。胚胎早期接觸高氧濃度的危害可能并不直接表現(xiàn)，而是體現(xiàn)在發(fā)育后期，從而影響妊娠。最近Nannasy等報(bào)道，將胚胎在第1、2天時(shí)用20%氧濃度培養(yǎng)，第3~5天時(shí)改用5%氧濃度培養(yǎng)，與一直用20%氧濃度組相比，其種植、妊娠或囊胚形成率并未提高。這可能是由于在3-5天時(shí)改用低氧濃度培養(yǎng)，并不能改善早期高氧濃度對(duì)其造成的損害[22]。

目前胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)中混合氣體的氧濃度尚未得到一致定論。有關(guān)氧濃度對(duì)胚胎發(fā)育影響的研究存在很大爭(zhēng)議。Dumoulin等報(bào)告低氧與正常氧濃度對(duì)胚胎發(fā)育和妊娠率的影響無(wú)顯著差異，但在延長(zhǎng)培養(yǎng)的胚胎中發(fā)現(xiàn)低氧濃度可以顯著提高囊胚形成率和囊胚細(xì)胞的數(shù)量[14]。Bahceci等發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境第3天的胚胎評(píng)分顯著高于正常氧濃度，但臨床結(jié)局無(wú)顯著差異[15]。Kea等的研究也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果[16]。Meintjes等發(fā)現(xiàn)低氧與正常氧的種植率和妊娠率無(wú)顯著差異，但囊胚形成率低氧組高于常規(guī)氧濃度組[23]。亦有研究顯示低氧可以提高著床與妊娠率[20]。這些研究的結(jié)果差異較大，也有可能是由于培養(yǎng)液不同，移植期不同或樣本量不足等造成的。此外，不同人群基線人口學(xué)特征也可能導(dǎo)致這一差異。因此還應(yīng)綜合其他因素來(lái)比較這些研究結(jié)果。

2011年Gomes Sobrinho等的Meta分析共納入了7個(gè)相關(guān)研究，其對(duì)胚胎受精率、妊娠結(jié)局分析指出，目前還沒(méi)有證據(jù)證明低氧濃度是必須的，雖然有一些關(guān)于低氧濃度培養(yǎng)有益的報(bào)道，但得出低氧濃度有助于IVF結(jié)局的結(jié)論還為時(shí)尚早，仍需要進(jìn)一步的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)來(lái)證明[24]。2012年來(lái)自Cochrane協(xié)作網(wǎng)的Bontekoe等人的系統(tǒng)綜述同樣納入了7個(gè)研究，通過(guò)分析顯示低氧濃度可以提高IVF的出生率，但其納入的研究方法學(xué)質(zhì)量較低，仍需更多高質(zhì)量的研究來(lái)證實(shí)[25]。目前這些研究都只關(guān)注于形態(tài)學(xué)和著床情況，今后的研究可以更多關(guān)注其他的潛能指標(biāo)，比如氧濃度導(dǎo)致基因表達(dá)的改變[26]。培養(yǎng)小鼠胚胎在Whitten培養(yǎng)液時(shí)基因H19的缺失低于在KSOM+AA培養(yǎng)液[27]。另一研究中顯示，在培養(yǎng)液中加入血清可以影響印記基因的表達(dá)[28]。這些為將來(lái)的氧濃度研究提供了一些可以考慮的檢驗(yàn)指標(biāo)。

綜上所述，本研究顯示在低氧濃度中培養(yǎng)胚胎可以提高新鮮移植周期的妊娠率，但并未顯著提高胚胎發(fā)育和FET結(jié)果。這可能是由于樣本量不足，也可能是由于低氧濃度并不一定對(duì)胚胎培養(yǎng)有所改善，亦有可能是低氧濃度僅對(duì)3~5 d的囊胚期胚胎發(fā)育有所幫助?？傊?，需要包含更多觀察因素、客觀指標(biāo)及大樣本的隨機(jī)對(duì)照研究來(lái)發(fā)現(xiàn)其差異，客觀說(shuō)明氧濃度對(duì)胚胎發(fā)育的影響。

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