優(yōu)良觀賞藥用地被植物——白芨組織培養(yǎng)及快速繁殖研究

鄒 娜，李 意，連芳青

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與藝術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045)

白芨(Bletilla striata)為蘭科白芨屬多年生草本植物，花期3—5月，其花紫紅色，花形奇特，是一種理想的耐蔭觀花地被植物，還可盆栽室內(nèi)觀賞或作切花材料供插花之用[1－2]。白芨不僅具有較高觀賞價(jià)值，亦是我國(guó)常用的中藥材之一，以干燥塊莖入藥，具有收斂止血、消腫生肌等功效[3]。此外，白芨莖中還含有較高的白芨膠，具有特殊的黏度特性，可作為增稠劑、混懸劑、保濕劑和助乳化劑等應(yīng)用于化妝品中，具有良好的效果[4]。

因其極高的觀賞藥用及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，野生白芨遭到了無(wú)限制人工采挖。同時(shí)，由于白芨種子自然條件下繁殖困難，野生白芨資源急劇減少。白芨目前已被國(guó)家列為珍稀瀕危的保護(hù)植物[5]。在其野生資源日益減少的情況下，大力推廣人工栽培[2，6]、并探索其行之有效的快速繁殖技術(shù)，可在解決其由于資源短缺制約白芨產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)對(duì)野生白芨資源的有效保護(hù)[7]。

白芨常規(guī)以分生繁殖為主，但分生繁殖系數(shù)低，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，而且耗種量大，不宜進(jìn)行大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)[8]。利用無(wú)菌播種技術(shù)，通過(guò)組織培養(yǎng)方法可以快速繁殖大量種苗，遠(yuǎn)較分株繁殖快捷高效[9]。目前，雖然白芨組織培養(yǎng)和設(shè)施栽培等人工繁育關(guān)鍵技術(shù)得到了一定的發(fā)展，但是還沒(méi)有組織培養(yǎng)技術(shù)迅速推廣應(yīng)用的報(bào)道[7]。因此，本研究的目的在于建立一套簡(jiǎn)單實(shí)用且易推廣的白芨組培快繁技術(shù)程序，為白芨的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展及對(duì)野生白芨資源的有效保護(hù)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白芨成熟未開(kāi)裂的長(zhǎng)卵圓形蒴果、花莖和地下莖。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體滅菌 外植體材料首先用流水沖洗20 min，再用小毛刷蘸洗衣粉溶液輕輕刷洗其表面，用流水沖洗干凈。在超凈工作臺(tái)上，用體積分?jǐn)?shù)為75%酒精溶液浸泡30 s，然后轉(zhuǎn)入1 g/L的HgCl2溶液中進(jìn)行表面消毒6～10 min，再用無(wú)菌水沖洗6次，吸干表面水分。花徑切去兩端并縱切成2半切口向下接到培養(yǎng)基上;塊莖每個(gè)切成4～6份接到培養(yǎng)基上;蒴果縱切，將粉末狀的細(xì)微種子均勻地撒于培養(yǎng)基上。每種外植體每次均接30瓶培養(yǎng)基，做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 原球莖誘導(dǎo) 以MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，研究細(xì)胞分裂素(6－BA、KT)和生長(zhǎng)素(2，4－D、NAA)對(duì)白芨原球莖誘導(dǎo)的影響。培養(yǎng)21 d后統(tǒng)計(jì)原球莖的誘導(dǎo)率。原球莖誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出的原球莖個(gè)數(shù)/接種的外植體個(gè)數(shù)(種子粒數(shù))。

1.2.3 壯苗生根培養(yǎng) 將分化出的小芽接入由不同濃度細(xì)胞分裂素6－BA和生長(zhǎng)素NAA配比組成的9種培養(yǎng)基，研究白芨苗的生根數(shù)，根長(zhǎng)，葉片數(shù)，葉長(zhǎng)和葉寬，以取得白芨一步成苗的最適培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基設(shè)15瓶，每瓶均接入6株白芨小芽，培養(yǎng)30 d后，記錄各數(shù)據(jù)。

1.2.4 移栽 選擇生長(zhǎng)勢(shì)旺盛，葉片數(shù)多且根系良好的瓶苗，打開(kāi)瓶蓋，室內(nèi)或95%遮光率的大棚內(nèi)放置3～5 d，然后小心取出瓶苗，洗凈根上附著的培養(yǎng)基。采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究蛭石、珍珠巖、泥炭土+蛭石、泥炭土+珍珠巖四種基質(zhì)對(duì)白芨組培苗移栽成活的影響。栽苗后注意遮光率和提高空氣濕度，定期做好觀察記錄。30 d后分別在每個(gè)基質(zhì)中抽取50株有代表性的苗進(jìn)行調(diào)查分析，測(cè)每組內(nèi)苗的成活率、植物球莖直徑、苗高、葉片數(shù)、葉寬。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)條件為:溫度(25±2)℃，光照1 800～2 500 lx，每天光照12 h;誘導(dǎo)和增殖生根培養(yǎng)均采用 MS培養(yǎng)基，蔗糖30 g/L，pH 6.5，瓊脂7 g/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的選擇

分別以白芨蒴果、花莖和地下莖為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，結(jié)果表明，不同外植體類(lèi)型的污染率都是隨著消毒時(shí)間的增加而減少，培養(yǎng)1個(gè)月后，消毒滅菌10 min的白芨蒴果(種子)的成活率可高達(dá)96.67%，平均污染率僅為3.33%，顯著低于相同處理?xiàng)l件下的地下莖和花莖平均感菌率(表1)。此外，以白芨花莖和地下莖作為繁殖材料，培養(yǎng)一段時(shí)間后地下莖變綠隨后變褐色，花莖雖也有膨大的現(xiàn)象，但更換多種培養(yǎng)基和重復(fù)多次實(shí)驗(yàn)均未誘導(dǎo)出愈傷組織或芽;而以白芨種子為培養(yǎng)材料，通過(guò)簡(jiǎn)單培養(yǎng)即可誘導(dǎo)出白芨原球莖。由此可見(jiàn)，白芨組織培養(yǎng)以蒴果(種子)為外植體的培養(yǎng)效果最好。

表1 白芨不同外植體的消毒效果Tab.1 Disinfection effects of different explants of Bletilla striata

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)白芨原球莖誘導(dǎo)及芽分化的影響

白芨種子播種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上約1周后吸水膨脹，并由黃褐色變成淡綠色，進(jìn)一步形成綠色小球體狀(即原球莖)。試驗(yàn)結(jié)果表明(表2):在培養(yǎng)基MS+6－BA 1.0 mg/L+2，4－D 0.5 mg/L中，原球莖誘導(dǎo)率只有5%(處理1)。將處理1中0.5 mg/L的2，4－D改為等濃度的NAA(處理2)，可使原球莖的平均誘導(dǎo)率由5%提高到90%，提高了17倍。說(shuō)明在1 mg/L細(xì)胞分裂素6－BA存在情況下，與2，4－D相比，NAA更有利于白芨原球莖的誘導(dǎo)。

當(dāng)保持培養(yǎng)基中的2，4－D濃度(0.5 mg/L)不變，將處理1中1.0 mg/L的細(xì)胞分裂素6－BA改為等濃度的KT(處理4)，原球莖的平均誘導(dǎo)率則有5%提高到70%，提高了13倍。說(shuō)明在0.5 mg/L 2，4－D存在情況下，與6－BA相比，KT更有利于白芨原球莖的誘導(dǎo)。而在NAA濃度(0.5 mg/L)一定的條件下，等濃度的細(xì)胞分裂素6－BA或KT處理，對(duì)白芨原球莖誘導(dǎo)效果相同(處理2和處理3)。

因此，在節(jié)約成本的情況下，僅采用MS+6－BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基(處理2)對(duì)白芨原球莖進(jìn)行誘導(dǎo)，便能達(dá)到很好的效果。但與生長(zhǎng)素2，4－D搭配時(shí)，KT比6－BA的誘導(dǎo)效果好(處理1和處理4)。

表2 不同細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素誘導(dǎo)白芨原球莖的結(jié)果Tab.2 Effects of different cytokinin and auxin on protocorm induction of Bletilla striata

在上述不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)約1個(gè)月后，原球莖頂部出現(xiàn)可見(jiàn)幼葉，不同培養(yǎng)基對(duì)白芨芽分化的誘導(dǎo)存在較明顯的差異。處理1中誘導(dǎo)的白芨小芽發(fā)黃，略見(jiàn)綠色，雖然處理4原球莖誘導(dǎo)率可以達(dá)到70%，但黃化現(xiàn)象較處理1更嚴(yán)重，繼續(xù)培養(yǎng)，芽分化的誘導(dǎo)效果很差。

處理2和3中原球莖誘導(dǎo)分化效果較好，其中處理3中的小苗每株平均有兩小葉，而處理2每株僅有一片小葉。就整齊度而言，處理3芽分化效果更好;就苗高而言，處理2和處理3誘導(dǎo)的白芨平均苗高分別為0.3 cm和0.5 cm。由此可見(jiàn)，對(duì)于白芨芽的分化誘導(dǎo)，處理3效果最好。

綜合考慮白芨原球莖誘導(dǎo)和芽分化的效果，篩選出白芨原球莖誘導(dǎo)及芽分化最適培養(yǎng)基配方為:MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L(處理3)，在該培養(yǎng)基中的原球莖平均誘導(dǎo)率可達(dá)90%，且誘導(dǎo)芽的分化效果最好。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)白芨壯苗生根培養(yǎng)的影響

將分化出的小芽轉(zhuǎn)接入含不同濃度6－BA和NAA配比組成的9種培養(yǎng)基中，以篩選白芨最佳壯苗生根培養(yǎng)基配方。

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)白芨壯苗及生根培養(yǎng)影響Tab.3 Effects of different media on lustihood and rooting culture induction of Bletilla striata

由表3可以看出:每株苗葉片數(shù)最多的4號(hào)培養(yǎng)基，其次是處理2，且其葉長(zhǎng)和葉寬值都較大。處理2、3和7，處理4和5，處理6和8之間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在NAA濃度相同的條件下，植株葉片數(shù)、葉長(zhǎng)和葉寬隨BA濃度的增加而減少。而在BA濃度相同的條件下(處理5和6，處理7、8和9)，植株葉片數(shù)、葉長(zhǎng)和葉寬隨NAA濃度的增加有降低趨勢(shì)，NAA保持在0.5 mg/L更有利于植株生長(zhǎng)。說(shuō)明細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素只有以一定適宜濃度配比，白芨組織培養(yǎng)才能獲得較好的生長(zhǎng)效果。

表4 不同基質(zhì)對(duì)白芨移栽成活的影響Tab.4 Effects of different matrix on survival of Bletilla striata after transplant

9種培養(yǎng)基中的苗都能生根，綜合考察苗的生根數(shù)和根長(zhǎng)，效果較好的處理為3、4和5，其中生長(zhǎng)的植株平均根數(shù)分別為:7.4 條、7.2 條和 6.6 條，平均根長(zhǎng)分別為:2.23，1.54，2.50 cm。

本試驗(yàn)采用的是壯苗和生根培養(yǎng)一步成苗的方法，對(duì)白芨壯苗培養(yǎng)效果較好的培養(yǎng)基為處理2和處理4，生根較好的培養(yǎng)基為處理3、4和5，所以壯苗培養(yǎng)和生根效果都較好的培養(yǎng)基為處理4，即:MS+6 － BA 0.45 mg/L+NAA 0.4 mg/L。

2.4 白芨組培苗煉苗移栽

從表4可以看出不同基質(zhì)移栽處理對(duì)白芨成活有不同的影響?？傮w上來(lái)說(shuō)用蛭石作為基質(zhì)來(lái)移栽白芨的試管苗的生長(zhǎng)能力較強(qiáng)，存活率可達(dá)95%以上;在成活苗的平均根數(shù)、植物球根直徑、苗高葉寬的數(shù)據(jù)對(duì)比分析中，可以得出用蛭石作為基質(zhì)的效果是最好的，而以珍珠巖作為基質(zhì)的移栽效果不理想。添加泥炭土的混合基質(zhì)對(duì)移栽效果也沒(méi)用明顯的改變。

3 討論與小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)以白芨種子為培養(yǎng)材料，通過(guò)簡(jiǎn)單培養(yǎng)即可誘導(dǎo)出白芨原球莖并進(jìn)行芽的分化，且壯苗培養(yǎng)與生根可同時(shí)進(jìn)行，即一步成苗，既節(jié)約了繁殖成本和培養(yǎng)時(shí)間，且操作簡(jiǎn)單易行便于推廣，符合市場(chǎng)要求(圖版)。前人在對(duì)白芨原球莖的誘導(dǎo)過(guò)程中，培養(yǎng)基中都不同程度的添加了馬鈴薯泥、香蕉泥和椰子汁等輔助成分[9]，而本實(shí)驗(yàn)僅采用常規(guī)激素組合對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)，效果同樣顯著(表2)，所以在大量生產(chǎn)中，可以從節(jié)約繁殖成本及便于操作的角度考慮使用簡(jiǎn)單培養(yǎng)基成分誘導(dǎo)白芨原球莖。

但是同大多數(shù)蘭科植物一樣，培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的種類(lèi)及濃度配比對(duì)白芨原球莖誘導(dǎo)及芽分化方向起著決定性的作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素2，4－D不僅抑制白芨原球莖的誘導(dǎo)，也不適宜于其原球莖的分化。而等濃度的NAA與KT或6－BA的配合使用對(duì)白芨原球莖的誘導(dǎo)效果很好(表2)。在壯苗生根培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素濃度相對(duì)細(xì)胞分裂素而言過(guò)高時(shí)，趨向于長(zhǎng)根，抑制莖芽的生長(zhǎng)(處理6)，而當(dāng)培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素相對(duì)生長(zhǎng)素而言過(guò)高時(shí)，雖然有明顯的芽分化，但使其分化苗不能正常生長(zhǎng)而死亡(處理7)。說(shuō)明在不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，為了促進(jìn)芽器官的分化或壯苗生根培養(yǎng)，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例。實(shí)驗(yàn)篩選出白芨原球莖誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基配方為:MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L。白芨為生根較容易植物，各處理培養(yǎng)基都促進(jìn)了白芨生根，綜合調(diào)查白芨的壯苗指標(biāo)和生根情況，發(fā)現(xiàn)以培養(yǎng)基為MS+6－BA 0.45 mg/L+NAA 0.4 mg/L作用較明顯。

圖版說(shuō)明:A:白芨蒴果;B:由白芨種子誘導(dǎo)出原球莖及芽的分化;C:白芨壯苗生根培養(yǎng);D:生根白芨無(wú)菌苗移栽到蛭石。Explanation of plates:A:Capsule of Bletilla striata as indicated by arrow;B:Protocorm induction and bud differentiation of Bletilla striata;C:Lustihood and rooting culture of Bletilla striata;D:The sterile seedlings of Bletilla striata after rooting was transplanted into the vermiculite.

瓶苗移栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白芨無(wú)菌苗最適宜的移栽生長(zhǎng)基質(zhì)為蛭石(表4)。蛭石具有良好的保水透氣性能，這也與白芨性喜溫暖而又濕潤(rùn)的環(huán)境，要求排水良好含腐殖土較多的沙壤土的特性吻合。此外，白芨瓶苗的葉較薄，出瓶后極易脫水而使葉邊緣焦枯，從而影響成活率，保證移栽前期的空氣濕度在80% ～90%，可提高移栽成活率。

本實(shí)驗(yàn)主要采用的是種子萌發(fā)方法繁殖，雖然增殖系數(shù)不高，但成苗迅速且苗的質(zhì)量好。本研究中，以種子作為外植體，30 d就開(kāi)始萌動(dòng)，60 d小苗就分化完全，這也與韋卡婭等的研究結(jié)果相一致[11]。研究表明利用幼嫩塊莖作為外植體誘導(dǎo)叢生芽，60 d才有小芽形成，且分化效率不高[11]。此外，白芨塊莖長(zhǎng)期在地下，受病菌和泥土污染嚴(yán)重，很難徹底滅菌，而且由于分化效率低、成苗所需時(shí)間長(zhǎng)等原因，白芨塊莖、側(cè)芽等作為外植體的方法目前遠(yuǎn)不如種子萌發(fā)方法普遍。

本研究得到白芨高效成苗的技術(shù)流程為:白芨成熟尚未開(kāi)裂的蒴果消毒滅菌處理后將種子播于培養(yǎng)基MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L進(jìn)行原球莖的誘導(dǎo)和芽的分化，50 d后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基MS+6－BA 0.45 mg/L+NAA 0.4 mg/L進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)30 d，而后將生根無(wú)菌苗移栽到蛭石中，移栽初期進(jìn)行適當(dāng)遮蔭并保持較高的空氣濕度，成活率可達(dá)到96%。

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