不同來源石油降解細(xì)菌的篩選鑒定

宋廣梅 王虹

【摘 要】從江蘇油田的原油和四種不同來源的土壤中，用三種不同的培養(yǎng)液篩選得到41株細(xì)菌。對(duì)具有較強(qiáng)降解能力細(xì)菌的其中8株菌進(jìn)行測序鑒定，初步確定屬于芽孢桿菌屬、短波單胞菌屬、假單胞菌屬、食堿桿菌屬及無色桿菌屬。

【關(guān)鍵詞】石油；降解；細(xì)菌

石油及其加工品進(jìn)入土壤，造成土壤的石油污染。微生物修復(fù)具有處理效果好，污染物殘留量低，不產(chǎn)生二次污染，對(duì)環(huán)境影響很小，能夠保持或改善植物生長的土壤環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)[1]。向污染土壤中投加環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、降解效能高的菌種或菌群是提高石油類污染物降解效率的重要手段[2]。

1.材料與方法

1.1菌種來源

（1）土樣：江蘇真武石油基地。①132#磕頭機(jī)（久置未用）旁表層土；②185#磕頭機(jī)（長期使用）旁表層土；③磕頭機(jī)附近草地草根土；④計(jì)量站旁表層油污土。

（2）原油：江蘇真武石油基地。

1.2富集培養(yǎng)基

（1）無機(jī)鹽培養(yǎng)液（g/L）：NaNO32，K2HPO41，K2HPO4·3H2O0.5，NaCl0.5，MgSO4·7H2O0.1，CaCl20.01，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01PH=7，石油烴（原油：柴油體積比1：4）1%

（2）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5，PH=7，石油烴0.5%

（3）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液，石油烴0.5%，表面活性劑50mg/L

1.3石油中細(xì)菌的培養(yǎng)分離

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基冷卻后，加入1%的原油混勻，倒平板。恒溫培養(yǎng)箱中30℃靜置培養(yǎng)。待平板長出菌落后選擇不同顏色及形態(tài)的單菌落，劃線純化，將純化菌株于試管斜面培養(yǎng)后于冰箱4℃保存。三個(gè)重復(fù)。

1.4土壤中石油烴降解菌的篩選

稱取10g土樣加入到裝有100mL富集培養(yǎng)液的三角瓶中。30℃振蕩培養(yǎng)7天。靜置30min，取10mL上清夜轉(zhuǎn)接入新鮮培養(yǎng)液中。重復(fù)上述步驟連續(xù)富集培養(yǎng)5次。

富集培養(yǎng)后，取菌液1mL梯度稀釋成10-6、10-7、10-8，取三種不同稀釋度菌液0.1mL涂布于分離培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)；待平板長出菌落后選擇不同顏色及形態(tài)的單菌落，劃線純化，將純化菌株于試管斜面培養(yǎng)后于冰箱4℃保存。三個(gè)重復(fù)。

1.5分離菌株的石油烴降解率測定

將所得菌株制成菌懸液（1.1～1.4×108個(gè)/ml），取1ml轉(zhuǎn)接入10ml加了1%石油烴的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中，28℃搖床培養(yǎng)7d后，用重量法[3，4]測定降解率。以不接菌的培養(yǎng)基作對(duì)照。

1.6高效石油降解菌鑒定

1.6.1菌株DNA提取

選取降解率較高（大于40%）的純菌株，30℃振蕩培養(yǎng)過夜。取1ml培養(yǎng)液到Eppendorf管中，離心，8000r/min，5min，棄去上清液，倒扣Eppendorf管在干濾紙上，空干溶液。將菌體重新懸浮于50μL 超純水，置旋渦混合器上旋轉(zhuǎn)混勻3s。將Eppendorf管放在沸水浴中煮10min。取出Eppendorf管冰浴10min。如此反復(fù)凍融三次，冷卻后迅速離心，12000r/min 8min。取上清液，-20℃保存?zhèn)溆?。

1.6.2菌株16SrDNA的PCR擴(kuò)增

以DNA為模板，引物27F：5`-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3`和1492R：5`-GGTTACCTTGTTACGACTT-3`；TACGACTT-3；總反應(yīng)體系為50μL，10×Buffer 5μL，25mmol/L MgCl24μL，2.5mmol/LdNTP 4μL，反向引物與正向引物各1μL，Taq酶0.25μL （5U/μL），模板DNA 2.5μL，ddH2O補(bǔ)足至50μL；PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃繼續(xù)延伸10min，4℃保存。

1.6.3菌株測序

擴(kuò)增成功后，產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。測序后，用Sequence Scanner v1.0軟件進(jìn)行序列分析，將有效序列到NCBI用Blast進(jìn)行對(duì)比。

2.結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌分離結(jié)果

從原油和不同培養(yǎng)時(shí)間土壤樣品中總篩選到41株細(xì)菌，其中石油中篩選出2株，土壤中39株。

2.2降解率測定結(jié)果

對(duì)篩選得到的41株細(xì)菌，測定其對(duì)石油烴的降解率，降解率最低1%，降解率高于40%的有12株，菌株編號(hào)為5、10、13、14、17、21、23、28、47、48、49、51，降解率分別為54.4%、61.8%、63.2%、69.5%、57.4%、47.9%、44.1%、45.6%、77.9%、63.2%、76.5%，其中5#菌來源于原油。

2.3石油降解菌株的鑒定

將降解率大于40%的12株細(xì)菌送上海生物工程公司測序，其中21、47、48、49這4株菌擴(kuò)增失敗未測序。其余8株16SrDNA序列測定結(jié)果用SequenceScannerv1.0軟件進(jìn)行序列分析與GenBank中已發(fā)表的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較，初步鑒定5#屬于芽孢桿菌屬（Lysinibacillussp.），10#屬于短波單胞菌屬（Brevundimonassp.），13#、17#、23#、28#屬于假單胞菌屬（Pseudomonassp.），14#屬于食堿桿菌屬（Alcanivoraxsp.），51#屬于無色桿菌屬（Achromobactersp.）。

3.結(jié)論

目前研究報(bào)道，能以烴類為唯一碳源和能源生長的微生物在自然界分布廣泛，約有70個(gè)屬（其中細(xì)菌28個(gè)屬，真菌30個(gè)屬），200多個(gè)種[5]。本研究從江蘇揚(yáng)州真武石油污染土壤中分離得到41株能利用石油的細(xì)菌，為石油污染土壤的微生物修復(fù)提供了新菌種資源；同時(shí)對(duì)其中降解率較高菌株進(jìn)行了初步鑒定，確定菌屬。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Aatry AR，Euis GM.Bioremediation：An effective remedied alternative for petroleum hydrocarbon contaminated soil[J].Environ.Prog，1992，11：312-318.

[2]袁紅莉，楊金水，王占生.降解石油微生物菌種的篩選及降解特性[J].中國環(huán)境科學(xué)，2003，23（2）：157-161.

[3]謝丹平，尹華，彭輝，等.混合菌對(duì)石油的降解[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2004，10（2）：210-214.

[4]污染源統(tǒng)一檢測分析方法編寫組.污染源統(tǒng)一檢測分析方法（廢水部分）[M].技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1983，135-136.

[5]丁克強(qiáng)，孫鐵珩，李培軍.石油污染土壤的生物修復(fù)技術(shù)[J].生態(tài)學(xué)雜志，2000，19（2）：50-5.