GSK－3β和 β－catenin 在彌漫性大B細胞性淋巴瘤組織中的表達及意義

葉春美 孫愛寧

(江蘇省泰興市人民醫(yī)院 江蘇泰興 225400;①蘇州大學附屬第一醫(yī)院)

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B－cell Ivmphoma，DLBCL)是最常見的非霍奇金淋巴瘤(nonHodgikin，S lymphomas，NHL)，約占成人NHL的30% ～40%。非霍奇金淋巴瘤(NHL)的病因和發(fā)病機制十分復雜，在此過程中多個癌基因激活或抑癌基因失活以及相應基因產(chǎn)物的高或低表達均與細胞信號傳導通路的異常密切相關[1]。Wnt信號轉導途徑是重要的細胞信號傳導通路，研究發(fā)現(xiàn)，在細胞癌變過程中，Wnt信號轉導途徑異常變化可能起重要作用，這種變化可由Wnt基因本身或通路任何成分發(fā)生改變而引發(fā)[2]。Wnt信號轉導途徑主要由以下幾種蛋白構成:β－連環(huán)素(β－catenin)、APC蛋白(adenomatous polyposiscoli protein)、糖原合成酶激酶 －3β(GSK－3β)及軸蛋白或傳導蛋白(axin)。目前國內有關GSK一3β和β －catenin在彌漫大B細胞淋巴瘤中表達研究尚未見報道，本研究采用免疫組化二步法檢測PGSK－3β(Ser－9)和β－catenin蛋白在彌漫性大B細胞性淋巴瘤、反應性增生的淋巴結組織中的表達，以了解GSK－3β和β－catenin在彌漫性大B細胞性淋巴瘤中表達及意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集泰興市人民醫(yī)院2000年9月～2010年9月存檔的DLBCL組織標本63例，所有標本的病理組織學類型均按2000年WHO的分型標準進行病理分型。其中男50例，女13例;年齡13～86歲，平均54.4歲;病變發(fā)生于淋巴結39例，發(fā)生于結外24例。所有患者均為初治患者，有明確病理診斷，且通過體檢、手術或影像學檢查確定腫瘤侵犯部位，采用Ann Arbor分期系統(tǒng)。所有人選患者均在我院接受2個療程以上的聯(lián)合化療CHOP方案，加或不加放療。另外收集14例反應性增生的淋巴結組織標本做為對照組。采用免疫組化SP二步法檢測PGSK－3β和β－catenin蛋白在彌漫性大B細胞性淋巴瘤(diffuse large B－cell lymphoma，DLBCL)組織中的表達。

1.2 試劑 β－catenin鼠抗人單克隆抗體、PGSK－3β(Ser－9)兔抗人單克隆抗體、PV26000通用二部法免疫組化檢測試劑及DAB顯色試劑盒均購自北京中山金橋生物技術有限公司。

1.3 方法 染色方法為二步法免疫組化染色法，β－catenin、PGSK－3β(Ser－9)抗體的工作濃度為1∶50。石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟，酒精梯度水化;切片置于10mmol的檸檬酸緩沖液中(pH6.0)煮沸10～20分鐘，室溫下冷卻20分鐘;切片用3%H2O2去離子水孵育5分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗3次，2分/次;滴加一抗β－catenin或APC，室溫放置60分鐘;PBS沖洗3次，2分/次;加一滴檢測二抗，室溫放置30分鐘;PBS沖洗3次，2分/次;應用DAB溶液顯色5～10分鐘;蘇木素復染、脫水、封片。

1.4 結果判斷 每例在顯微鏡下隨機選擇10個高倍鏡視野(×400)，每個視野計數(shù)100個淋巴結細胞觀察，PGSK－3β(Ser－9)陽性染色呈現(xiàn)棕黃色至棕褐色細小顆粒狀，位于細胞漿和/或細胞核。強陽性()，中度陽性()，弱陽性(+)，陰性(－)。為3分，為2分，+為1分，－為0分。β－catenin陽性染色呈棕黃色顆粒，位于細胞漿和/或細胞核，＞20%腫瘤細胞核染色陽性為陽性，強陽性()，中度陽性()，弱陽性(+)，陰性(－)。＜20%的腫瘤細胞染色或1分視為陰性，和為陽性[3]。所有染色經(jīng)兩名醫(yī)生獨立評判，若有異議，經(jīng)雙頭鏡共同評判達成共識。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件，采用χ2檢驗和Spearman等級相關分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 β－catenin 定位于細胞漿和/或細胞核，彌漫性大B細胞性淋巴瘤(diffuse large B－cell lymphoma，DLBCL)組織β－catenin陽性表達率(28.57%)，反應性增生的淋巴結組織(0)，兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義(校正 χ2=5.220，P ＜0.05)。彌漫性大B細胞性淋巴瘤可見核表達，表達率分別為(14.29%)，而反應性增生的淋巴結組織未見核表達。見表1。

表1 β－catenin在彌漫性大B細胞性淋巴瘤，反應性增生性淋巴結組織中的表達(例)

2.2 PGSK－3β 定位于細胞漿和/或細胞核中，彌漫性大B細胞性淋巴瘤(diffuse large B－cell lymphoma，DLBCL)組織PGSK－3β陽性表達率(38.10%)，反應性增生的淋巴結組織陽性表達率(7.14%)，兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義(校正χ2=5.005，P ＜0.05)。見表2。

表2 PGSK－3β在彌漫性大B細胞性淋巴瘤，反應性增生性淋巴結組織中的表達(例)

2.3 PGSK－3β和β－catenin陽性表達的關系 63例彌漫性大B細胞性淋巴瘤中，PGSK－3β(Ser－9)和β－catenin蛋白共同陽性18例，6例PGSK－3β陽性者，β－catenin蛋白陰性。彌漫性大B細胞性淋巴瘤中PGSK－3β(Ser－9)和β－catenin蛋白表達呈顯著正相關(r=0.767，P ＜0.01)。

3 討論

人類β－catenin基因定位于染色體的3p2113－22，全長2312 kb，有16個外顯子[4]。由β－catenin基因編碼的β－catenin分子量約為92～95kD，含781個氨基酸殘基[5]，氨基端有GSK－3β的磷酸化位點[6]。β－catenin是Wnt信號轉導途徑的正向調節(jié)因素，而APC蛋白、GSK－3β及axin等是負向調節(jié)因素[7]。正常成熟細胞中沒有Wnt信號，胞漿內的β－catenin大部分與細胞膜上的鈣粘蛋白E－cadherin結合，少部分與胞漿內APC蛋白、GSK－3β及軸蛋白結合，三者結合形成復合體后，GSK－3β通過磷酸化可降解β－catenin，因而胞漿內游離βcatenin水平極低，不能進入細胞核調控相應基因表達[8]。在多種因素作用下Wnt信號異常激活或β－catenin發(fā)生突變，腫瘤細胞中β－catenin的磷酸化和降解不能正常進行，游離的非磷酸化β－catenin在胞漿內大量聚積后進入核內，在核內異常蓄積的β－catenin與Tcf/Lef(Tcell transcriptional factor/Lymphoid enhancer factor)形成復合物，通過Tcf/Lef核轉錄系統(tǒng)激活相應靶基因(如c－myc、cyclin D1等)，引起細胞增殖和分化失控，最終導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[9，10]。本組結果顯示，β－catenin主要定位于在細胞漿中，彌漫性大B細胞性淋巴瘤(diffuse large B－cell lymphoma，DLBCL)組織 β－catenin陽性表達率(28.57%)，反應性增生的淋巴結組織均為陰性表達，兩者比較，差異顯著(校正 χ2=5.220，P ＜0.05)。彌漫性大 B細胞性淋巴瘤可見核表達，表達率為(14.29%)，而反應性增生的淋巴結組織未見核表達。以上結果提示β－catenin的陽性表達尤其是細胞核表達與彌漫性大B細胞性淋巴瘤的發(fā)生有關。

GSK－3是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是糖元合成酶激酶的限速酶之一，在哺乳動物體內GSK－3主要有2種亞型:GSK－3α和GSK－3β，相對分子質量分別為51和47 ku，二者有類似的結構和底物，但是功能不同。GSK－3基因有高度保守性，從果蠅到人GSK－3激酶結構域序列上有90%以上同源性。GSK－3α和GSK－3β基因有85%同源性，在催化結構域高達93%的同源性，二者分別位于19q13.2和3q13.3。GSK－3β基因啟動子含有多個CAAT盒和正負轉錄反應元件。GSK－3β對底物的識別與一般激酶不同，GSK－3β底物一般要求有共同的S/TXXXS/T(P)序列，其中x為任意氨基酸，底物磷酸化的發(fā)生首先要在另一個激酶的作用下使底物S/TXXXS/T(P)序列上C端的絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化，磷酸化后的起始位點引導GSK－3進一步使底物磷酸化，形成多位點磷酸化結構域[11]。GSK－3β可磷酸化多種底物，包括參與代謝和信號調節(jié)的蛋白、結構蛋白和各種轉錄因子，例如糖原合成酶、微管相關蛋白和β－連環(huán)蛋白等[12]。此外，GSK－3β還影響多種轉錄因子如AP－1，β－連環(huán)蛋白，CREB，Myc和 NF－kB等的基因的表達[13]。GSK－3β活性受多種機制調節(jié)，GSK－3β磷酸化是研究最多的調節(jié)方式之一，GSK－3βSer－9磷酸化后其活性降低，阻止β－連環(huán)蛋白磷酸化，因此，胞漿內β－連環(huán)蛋白含量增加，更多的β－連環(huán)蛋白進入細胞核內與DNA結合蛋白結合而調控細胞周期蛋白(cyclin)D1，e－Myc等多種基因的表達。這些因子的激活與淋巴瘤、肺癌和結腸癌等多種腫瘤有關[14]。在本研究中，我們運用免疫組化方法研究pGSK－3β，并綜合評價了GSK－3β失活的意義。研究發(fā)現(xiàn)，PGSK－3β主要定位于細胞漿中，63例彌漫性大B細胞性淋巴瘤(diffuse large B－cell lymphoma，DLBCL)中，24例存在GSK－3β失活。14例反應性增生的淋巴結組織中，僅1例存在GSK－3β失活，兩者比較，差異顯著(校正 χ2=5.005，P ＜0.05)。同時，我們發(fā)現(xiàn) pGSK－3β陽性與β－catenin陽性表達顯著相關?？傊?，我們的數(shù)據(jù)支持GSK－3β在彌漫性大B細胞性淋巴瘤發(fā)生機制中具有重要意義。

以上研究表明，在彌漫性大B細胞性淋巴瘤發(fā)生機制中，GSK－3βSer－9磷酸化后其活性降低，阻止了β－連環(huán)蛋白磷酸化，胞漿內β－連環(huán)蛋白含量增加，更多的β－連環(huán)蛋白進入細胞核內，激活了一系列有關細胞增殖、運動等方面的靶基因轉錄，最終導致了彌漫性大B細胞性淋巴瘤的發(fā)生。

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