STAT5和VEGF 在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的相關(guān)性研究

邵紅玲 許學(xué)亮

(山東省臨沂市交通醫(yī)院 山東臨沂 276002;①臨沂市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科)

非小細(xì)胞肺癌(non－small cell lung cancer，NSCLC)占原發(fā)性肺癌的80%，而其中55%的患者在診斷時(shí)就已經(jīng)是局部晚期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在各種死亡信號(hào)刺激后發(fā)生的一系列瀑布式激活的主動(dòng)性細(xì)胞死亡過程，凋亡的發(fā)生受促進(jìn)性及抑制性雙向因素的共同調(diào)節(jié)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子5(signal transducer and activator of transcription 5，STAT5)是STATs蛋白家族的重要成員，具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活轉(zhuǎn)錄雙重功能。該信號(hào)通路接受生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等細(xì)胞外信號(hào)刺激，作用于細(xì)胞核內(nèi)特異的DNA片段，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，參與腫瘤的發(fā)生和演進(jìn)[2，3]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是在內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂過程中被發(fā)現(xiàn)的高度特異的生長(zhǎng)因子，在腫瘤血管形成過程中起重要作用，故其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)[4]。有研究報(bào)告VEGF可以促進(jìn)新生血管的形成，并在腫瘤血管形成的信號(hào)通路中相互作用。本文通過檢測(cè)STAT5和VEGF在NSCLC中的表達(dá)，分析STAT5和VEGF與患者臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)及其兩者之間的相關(guān)性，探討其與肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以期尋找非小細(xì)胞肺癌早期診斷及判斷預(yù)后的分子指標(biāo)，為臨床應(yīng)用探索更有價(jià)值的生物學(xué)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集臨沂市人民醫(yī)院病理科存檔2010年1月～2011年9月手術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為NSCLC的石蠟包埋塊68例。患者術(shù)前均未接受任何化療及其他治療，其中，男43例，女25例，年齡45～78歲，平均56.33歲。按WHO組織學(xué)分類、分期，鱗癌36例，腺癌32例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者33例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例;Ⅰ～Ⅱ期者39例，Ⅲ～Ⅳ期者29例;高～中分化者36例，低分化者32例。同時(shí)選取癌旁正常肺組織26例作為對(duì)照組織。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑。STAT5單抗及相應(yīng)二抗、免疫組化SP試劑盒及DAB顯色試劑盒購自于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。VEGF為鼠抗人單克隆抗體，購自福州邁新公司。

1.2.2 標(biāo)本及處理。所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，常規(guī)于60℃溫箱烘烤2～3h，撈片后置于60℃烤箱干燥24h，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 免疫組織化學(xué)SP法。68例NSCLC和26例癌旁正常肺組織均進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。樣本的石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化、置于抗原修復(fù)液中修復(fù)5min后，采用Evnison法行免疫組化染色，再用DAB顯色、復(fù)染，檢測(cè)STAT5、VEGF的表達(dá)。

1.2.4 陽性表達(dá)的判斷標(biāo)準(zhǔn)。以腫瘤細(xì)胞和正常肺組織上皮細(xì)胞的胞質(zhì)或胞核內(nèi)出現(xiàn)明顯的棕黃色或黃褐色顆粒為陽性細(xì)胞，著色定位準(zhǔn)確視為陽性結(jié)果。三者均采用半定量積分法判斷結(jié)果，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占比例分別計(jì)分，兩積分之和來判斷最后結(jié)果。按染色強(qiáng)度記為0～3分:不著色為0分，輕度著色為1分，中度著色為2分，強(qiáng)著色為3分。按陽性細(xì)胞數(shù)記為0～4分:無著色為0分，＜25%為l分，25% ～50%為2分，50% ～75%為3分;＞75%為4分，兩個(gè)積分相加:0為(－)，1 ～2為弱陽，3 ～ 4為(+)，5 ～ 6為();7分為()。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。組間陽性率比較采用χ2檢驗(yàn);組間平均值比較采用t檢驗(yàn);兩者間的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STAT5和VEGF在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá) STAT5蛋白陽性定位于胞漿，部分在胞核，VEGF定位于胞漿及胞膜。68例NSCLC 中，STAT5陽性62例(91.2%)，VEGF陽性52例(76.5%)。26例對(duì)照組中，STAT5陽性2例(7.69%)，VEGF陽性6例(23.1%)。NSCLC組的STAT5和VEGF的陽性表達(dá)率均高于對(duì)照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，見表1。

表1 NSCLC組和對(duì)照組STAT5、VEGF和EGFR表達(dá)情況(%)

2.2 STAT5和VEGF的陽性表達(dá)與NSCLC臨床病理特征之間的關(guān)系

2.2.1 STAT5的陽性表達(dá)與NSCLC臨床病理特征之間的關(guān)系。STAT5的陽性表達(dá)與NSCLC組織學(xué)類型有關(guān)，STAT5在腺癌組織中的表達(dá)明顯高于鱗癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。STAT5的陽性表達(dá)與NSCLC分化程度、有/無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2 STAT5的陽性表達(dá)與NSCLC臨床病理特征之間的關(guān)系

2.2.2 VEGF的陽性表達(dá)與NSCLC臨床病理特征之間的關(guān)系。VEGF的陽性表達(dá)與NSCLC的分化程度、有/無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。低分化癌組的VEGF陽性表達(dá)率明顯高于中分化癌和高分化癌組;伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC組VEGF的陽性表達(dá)率明顯高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC組;VEGF的陽性表達(dá)率在NSCLC中隨TNM分期的增加而增加，在Ⅲ+Ⅳ期中的陽性表達(dá)率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期。VEGF的陽性表達(dá)與NSCLC的組織學(xué)分型無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見表3。

2.2.3 STAT5和 VEGF的陽性表達(dá)在 NSCLC組織中的相關(guān)性。Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，68例NSCLC組織中STAT5與VEGF的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(rs=0.311，P ＜0.01)。

表3 VEGF的陽性表達(dá)與NSCLC臨床病理特征之間的關(guān)系

3 討論

STATs是影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡的一類潛在的轉(zhuǎn)錄因子，迄今為止，在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)STAT家族包括7個(gè)成員，即STAT1－6，其中STAT5和STAT3與腫瘤發(fā)生關(guān)系最為密切。STAT5是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子家族中的重要一員，被認(rèn)為是細(xì)胞增殖促進(jìn)因子和凋亡抑制因子。它的異常激活和過度表達(dá)能誘發(fā)腫瘤的形成。在人類的多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了STAT5的異常激活，如在乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、白血病、肺癌等[5～7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，STAT5在NSCLC組織中的陽性表達(dá)率為91.2%，明顯高于正常癌旁肺組織7.69%的陽性表達(dá)率，提示STAT5的過表達(dá)促進(jìn)了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，STAT5的陽性表達(dá)與組織學(xué)類型有關(guān)，在腺癌中的表達(dá)明顯高于鱗癌，而與分化程度、有/無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)。這可能與腺癌的惡性程度高有關(guān)。

腫瘤持續(xù)性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移需要新生血管的形成。在腫瘤新生血管形成的影響因素中，最有效和特異的因子就是VEGF?，F(xiàn)有研究表明:VEGF是作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生成調(diào)控因子，它可與血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性地結(jié)合，能增強(qiáng)血管通透性，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)血管內(nèi)物質(zhì)的滲出，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，激活蛋白酶致使細(xì)胞外基質(zhì)降解，有利于新生血管生長(zhǎng)及延伸，為內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)[8，9]。最近幾年的研究表明，肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后與其血管生成有著密切的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示VEGF在NSCLC中的陽性表達(dá)率為76.5%，明顯高于正常癌旁肺組織23.1%的陽性表達(dá)率，提示VEGF的過表達(dá)促進(jìn)了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，VEGF的陽性表達(dá)與NSCLC有/無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)。VEGF在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC組中的陽性表達(dá)率明顯高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC組，說明VEGF的過表達(dá)促進(jìn)了NSCLC發(fā)生淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。VEGF在NSCLC中的陽性表達(dá)隨TNM分期的增加而增加，在Ⅲ+Ⅳ期中的陽性表達(dá)率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期，更加表明VEGF在NSCLC中的過表達(dá)促進(jìn)了癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，加速了癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，與 Yoshida[10]等的研究結(jié)果一致。VEGF的陽性表達(dá)與NSCLC的組織學(xué)分型無關(guān)，在鱗癌和腺癌中的陽性表達(dá)無明顯差異，這說明肺癌的不同病理類型具有同樣或相似的分泌VEGF的特性。

肺癌是典型的血管依賴性腫瘤，腫瘤的生長(zhǎng)離不開新生血管的形成，而新血管的生成又增加了腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)。VEGF促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，加速腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。我們的研究結(jié)果顯示STAT5與VEGF在NSCLC中的陽性表達(dá)呈明顯正相關(guān)(rs=0.311，P ＜0.01)。這說明STAT5與VEGF在NSCLC發(fā)生發(fā)展中相互作用，共同促進(jìn)NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移，STAT5蛋白的激活雖然不會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，但它卻是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因子。VEGF通過促進(jìn)新生血管的形成加速了NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移。

腫瘤的發(fā)生是多種癌基因激活，抑癌基因缺失以及其他外在因素共同作用的結(jié)果，STAT5信號(hào)傳導(dǎo)通路過度激活后，上調(diào)VEGF和EGFR表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、血管形成、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，易引起腫瘤細(xì)胞耐藥等。隨著JAKs/STATs信號(hào)途徑、VEGF的深入研究，他們?cè)谀[瘤發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用越來越受到重視。雖然STAT5和VEGF導(dǎo)致腫瘤的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但是深入探討STAT5和VEGF與各信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間的相互作用機(jī)制，及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系還有大量工作要做。

[1] Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2008，58(2):71

[2] Hua Y，Richard J.The STATs of cancer－ new molecular targets come of age[J].Nature(Review/Cancer)，2004，2(4):97

[3] Aaronson DS，Horvath CM.A road map for those who don＇t know JAK－ STAT[J].Science，2003，29(6):1653

[4] Zhou YH，Tan F，Hess KR.The expression of PAX6，F(xiàn)TEN，vascular endothelial growth factor，and epidermal growth factor receptor in gliomas:relationship to tumor grade and survival[J].Clin Cancer Res，2003，9(9):3369

[5] Hoelbl A，Schuster C，Kovacic B，et al.Stat5 is indispensable for the maintenance of bcr/abl－ positive leukaemia[J].EMBO Mol Med，2010，2(3):98

[6] Gu L，Vogiatzi P，Puhr M，et al.Stat5 promotes metastatic behavior of human prostate cancer cells in vitro and in vivo[J].Endocr Relat Cancer，2010，17(2):481

[7] 許學(xué)亮，王鴻程，孫紹娟，等.STAT5和Bcl－xl在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性分析[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2006，22(6):818

[8] Lutsenko S V，Kiselev S M，Severin S E.Molecular mechanisms of tumor angiogenesis[J].Biochemistry(Mosc)，2003，68:286

[9] GuoX，ChenY，Xu Z，et al.Prognostic significance of VEGF － C expression in correlation with COX － 2，lymphaticmicrovesseldensity，and clinicopathologic characteristics in human non－small cell lung cancer[J].Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)，2009，41(3):217

[10] Yoshida S，Amano H，Hayashi I，et al.COX － 2/VEGF dependent facilitation of tumor associated angiogenesis and tumor growth in vivo[J].Lab Invest，2003，83(10):1385

[11] Byers LA，Heymach JV.Dual targeting of the vascular endothelial growth factor and epidermal growth factor receptor pathways:rationale and clinical applications for non － small cell lung cancer[J].Clin Lung Cancer，2007，8(Suppl2):79