BMP2基因重組慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定＊

林昭偉，李 奇，林荔軍，劉云龍，帥 明，謝小波

（南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院骨科中心，廣州 510282）

骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）是促進(jìn)骨化的主要因子，可在骨損傷局部及異位促進(jìn)細(xì)胞增殖，提高其堿性磷酸酶活性，也是惟一能夠單獨(dú)在異位誘導(dǎo)骨化形成的信號分子，這使其在骨關(guān)節(jié)疾病特別是骨折、骨缺損的臨床治療中具有極大的潛在應(yīng)用價(jià)值［1－5］。將BMP2復(fù)合載體材料在特定部位釋放，存在體內(nèi)半衰期短，容易被體液沖走或稀釋等缺點(diǎn)，很難保持局部有效治療濃度。慢病毒載體對非分裂細(xì)胞能進(jìn)行高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)，攜帶目的基因整合到靶細(xì)胞基因組，使之能長期、穩(wěn)定和安全地在全身或局部表達(dá)，成為目前較理想的基因轉(zhuǎn)移載體［6－8］。為此，本研究嘗試構(gòu)建重組慢病毒載體質(zhì)粒pLV.EX2d.P／neo－EF1A＞BMP2／T2A／EGFP，為骨缺損的基因治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 慢病毒載體質(zhì)粒pLV.Des2d.P／neo，pDONR221，模板DNA，大腸桿菌Stbl3購自Cyagen公司，Gateway?BP ClonaseTMⅡEnzyme Mix，Gateway?LR ClonaseTMⅡPlus Enzyme Mix購自Invitrogen公司，QIAquick Gel Extraction Kit購自Qiagen公司，質(zhì)粒小提試劑盒購自Tiangen公司，Taq DNA Polymerase，dNTP Mix，GeneRuler？1kb DNA Ladder購自Fermentas公司，PrimeSTARTMHS DNA Polymerase購自Takara公司，XmaⅠ和EcoRⅤ限制性內(nèi)切酶購自Neb公司。其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增 attB1－Kozak－BMP2－T2A－EGFP－attB2。

1.2.1.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Genbank的BMP2基因編碼區(qū)（CDS）和 Gateway技術(shù)設(shè)計(jì)相應(yīng)引物。attB1－Kozak－BMP2－F基因引物：5′－GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTG CCA CCA TGG TGG CCG GGA CCC GC－3′。BMP2－T2A－R－1基因引物：5′－AAG ACT TCC CCT GCC CTC TCC GGA GCC GCG CAC CCA CAA CCC TCC－3′。T2A－R－2基因引物：5′－GGC CGG GAT TTT CCT CCA CGT CCC CGC ATG TTA GAA GAC TTC CCC TGC CCT CT－3′。T2A－EGFP－F基 因 引 物：5′－CGT GGA GGA AAA TCC CGG CCC CAT GGT GAG CAA GGG CGA GG－3′。attB2－EGFP－R基因引物：5′－GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTT TAC TTG TAC AGC TCG TCC ATG－3′。引物由廣州賽業(yè)生物公司合成。PCR融合過程示意圖（圖1）。

1.2.1.2 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序 取一高壓滅菌0.2mL EP管，并建立以下反應(yīng)體系：5×Primer STARTMBuffer（Mg2＋Plus）：10μL；dNTP Mixture（2.5μmol）：4μL；引物－F（10μmol）：1μL；引物－R（10μmol）：1μL；模板 DNA：1μL；Primer STARTMHS DNA Polymerase：0.5μL；補(bǔ)加雙氧水至總體積50μL。98℃預(yù)變性3min，98℃變性20s，60℃退火30s，72℃延伸1.5 min共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min，6×loading Buffer終止反應(yīng)，用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，DNA瓊脂糖凝膠電泳回收參照QIA－quick的瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒進(jìn)行回收，－20℃冰箱保存。

1.2.2 利用 Gateway Technology構(gòu)建 pDown－BMP2－T2AEGFP 在25℃的條件下BP反應(yīng)1h，反應(yīng)體系：attB1－KBMP2－T2A－EGFP－attB 2∶100ng；pDONR 221∶100ng；BP clonase：1μL；TE buffer：up to 5μL。加入0.5μL蛋白酶 K于37℃終止反應(yīng)10min，轉(zhuǎn)化BP反應(yīng)產(chǎn)物到大腸桿菌Stbl3，把100μL轉(zhuǎn)化物涂到含有50μg／mL Kan的LB平板上37℃孵育過夜。XmaⅠ和EcoRⅤ雙酶切鑒定篩選陽性克隆，挑取陽性克隆質(zhì)粒，并將陽性克隆的質(zhì)粒送賽業(yè)生物公司測序，測序引物：pUpDo－flank－F：CGG CCA GTC TTA AGC TCG GG；pUpDo－flank－R：AAT ACG ACTC ACT ATA GGG GA；W1F：ACA CCA GGT TGG TGA ATC AG。

1.2.3 利用 Gateway Technology構(gòu)建 pLV.EX2d.P／neo－EF1A＞BMP2／T2A／EGFP 在25℃條件下LR反應(yīng)16h，反應(yīng) 體 系：pDown－BMP2－T2A－EGFP：15.02ng；pUp－EF1A：12.89ng；母載體pLV.Des2d.P／neo：60.28ng；LR clonase：1 μL；TE buffer：up to 5μL。加入0.5μL蛋白酶K于37℃終止反應(yīng)10min。轉(zhuǎn)化LR反應(yīng)產(chǎn)物到大腸桿菌Stbl3，菌落PCR篩選陽性克隆，反應(yīng)體系：10×Taq Buffer with（NH4）2SO4：3μL；dNTP Mixture（2μmol）：3μL；MgCl2：2μL；引物－F（10μmol）：1.2μL；引物－R（10μmol）：1.2μL；Taq DNA polymerase：1.5μL；模板DNA：2μL；滅菌水：16.1μL；總體積30 μL。94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1.5min共29個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。挑取陽性克隆質(zhì)粒，陽性克隆送交賽業(yè)生物公司測序，測序引物：pLV－Final－internal－F：CAA GTT TGT ACA AAA AAG CAG GCT；pLVFinal－internal－R：AGC CTG CTT TTT TGT ACA AAC TTG。

圖1 PCR融合過程示意圖

2 結(jié) 果

2.1 pDown－BMP2－T2A－EGFP的構(gòu)建（圖2） 隨機(jī)挑取2個(gè)克隆，pDown－BMP2－T2A－EGFP用限制性內(nèi)切酶 XmaⅠ和EcoRⅤ雙酶切后，酶切條帶理論大小為1 100bp，與目的條帶大小相符的克隆即為陽性克隆，測序結(jié)果同GenBank中報(bào)道序列一致，波譜未列出。

圖2 pDown－BMP2－T2A－EGFP酶切鑒定

2.2 pLV.EX2d.P／neo－EF1A＞BMP2－T2A－EGFP重組質(zhì)粒構(gòu)建（圖3） 隨機(jī)挑取6個(gè)克隆，菌落PCR鑒定條帶理論大小為2 000bp，與目的條帶大小相符的克隆即為陽性克隆，測序結(jié)果同GenBank中報(bào)道序列一致，波譜未列出。載體結(jié)構(gòu)圖譜見圖4。

圖3 pLV.EX2d.P／neo－EF1A＞BMP2－T2A－EGFP PCR鑒定

圖4 pLV.EX2d－EF1A＞BMP－2／T2A／EGFP載體結(jié)構(gòu)圖譜

3 討 論

生物活性因子在促進(jìn)骨缺損修復(fù)過程中發(fā)揮極其重要的作用，而促進(jìn)新骨形成的活性因子顯得尤為重要。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是參與骨形成的重要活性物質(zhì)，其中BMP2是BMP家族成員中作用最強(qiáng)的因子。BMP2直接或通過載體局部應(yīng)用可促進(jìn)骨形成［1－2］。但BMP2屬于小分子物質(zhì)，如果單純將其于局部注射，勢必被組織液稀釋或血液帶走，同時(shí)BMP2半衰期較短，在注入體內(nèi)后，輕易地被體內(nèi)蛋白水解酶水解失去活性，難以發(fā)揮有效的骨誘導(dǎo)作用。而近年來發(fā)展的緩釋技術(shù)則存在操作復(fù)雜、包封率低、價(jià)格昂貴，且有效安全的局部劑量很難達(dá)到，生物活性不能得到最大利用，難以全面滿足組織工程骨體內(nèi)修復(fù)這一復(fù)雜過程的需要。因此，尋找一種有效的BMP2局部穩(wěn)定、緩慢釋放方法就顯得極為重要。

基因治療可使生物活性因子在局部穩(wěn)定地釋放，在骨缺損修復(fù)領(lǐng)域中顯示出良好的運(yùn)用前景。許多研究證實(shí)，基因治療可有效促進(jìn)骨再生［9－12］。目前，基因治療的載體主要分為病毒載體和非病毒載體。由于病毒基因組結(jié)構(gòu)簡單，易于改造和操作，且感染效率高，有較高靶細(xì)胞特異性，這些都是其他載體系統(tǒng)無法比擬的。慢病毒載體是一類逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它既能夠感染分裂細(xì)胞，也能夠感染非分裂細(xì)胞，由于慢病毒載體能夠感染大多數(shù)非分裂細(xì)胞，以及具有高效地整合和穩(wěn)定地表達(dá)目的基因于靶細(xì)胞的能力，所以，已被廣泛應(yīng)用于各種基因治療實(shí)驗(yàn)研究［13－15］。Gateway技術(shù)是基于λ噬菌體位點(diǎn)專一重組系統(tǒng)的一種通用的克隆技術(shù)，能夠快速地、高特異性地將異源DNA片斷克隆到不同的載體中。這一技術(shù)在插入的目的DNA片段兩端整合att L1和att L2兩個(gè)側(cè)端重組序列，來構(gòu)建一個(gè)類似通道的結(jié)構(gòu)并稱之為入門克隆。本研究顯示，直接調(diào)取BMP2基因，能與數(shù)據(jù)庫序列保持高度一致，減少變異，利用 BP 反 應(yīng) 構(gòu) 建 入 門 克 隆 pDown－BMP2－T2A－EGFP，以pLV.Des2d.P／neo為目的載體利用LR反應(yīng)構(gòu)建pLV.EX2d.P／neo－EF1A＞BMP2／T2A／EGFP。

經(jīng)過測序證明，本研究成功構(gòu)建了攜帶BMP2基因的慢病毒載體質(zhì)粒，同時(shí)加入了與之共表達(dá)的報(bào)告基因EGFP和NEO抗性基因，有利于感染后細(xì)胞的觀察和篩選，為下一步進(jìn)行病毒包裝及轉(zhuǎn)染奠定基礎(chǔ)。

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