丁酸鈉通過下調(diào)細(xì)胞干擾素調(diào)節(jié)因子－1抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE2吲哚胺－吡咯2，3－雙加氧酶的表達(dá)＊

郭芝剛，曾 軍，張錦宏，何玉文△

（廣州醫(yī)學(xué)院：1.基礎(chǔ)學(xué)院；2.第一附屬醫(yī)院藥劑科 510120）

研究表明，吲哚胺－吡咯2，3－雙加氧酶（indoleamine－pyrrole 2，3－dioxygenase，IDO）在腫瘤逃避免疫監(jiān)視、腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用［1－2］。多種人腫瘤細(xì)胞和原發(fā)性腫瘤組織表達(dá)IDO，其抑制抗原特異性T淋巴細(xì)胞的增生，使腫瘤逃避機(jī)體的免疫攻擊［3－4］。研究發(fā)現(xiàn)，抑制IDO表達(dá)可以抑制自發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)［5］，丁酸鈉（sodium butyrate，NaB）也能抑制IDO的表達(dá)，但機(jī)制不明確。本研究主要探討NaB抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE2內(nèi)IDO表達(dá)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 CNE2細(xì)胞株為人鼻咽癌上皮細(xì)胞，由中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院基礎(chǔ)部贈(zèng)送。

1.1.2 試劑 試劑Soudim butyrade，購(gòu)自Sigma公司；注射用重組人干擾素γ（IFN－γ），海雷泰，國(guó)藥準(zhǔn)字S19990059；兔抗IDO抗體（中山大學(xué)微生物與生化制藥研究室制作）；β－肌動(dòng)蛋白抗體（β－actin）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶（HPR）標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自Promega公司；SYBR Green PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Toyobo公司；RPMI－1640培養(yǎng)基粉末購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；新生牛血清購(gòu)自北京晨曦勇創(chuàng)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) CNE2細(xì)胞用含10%新生牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，以每孔3×105個(gè)接種6孔板，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)60%～70%，加入NaB和（或）IFN－γ處理細(xì)胞。

1.3 Western blot免疫印跡檢測(cè)IDO的表達(dá) 取上述培養(yǎng)的細(xì)胞，加入2mmol／L NaB處理CNE2細(xì)胞0、6、12、24h后，加入100U／mL IFN－γ刺激24h后裂解細(xì)胞，進(jìn)行蛋白定量，每孔20μg蛋白上樣，120V電壓進(jìn)行10%SDS－PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，在100V，90min的條件下電轉(zhuǎn)，5%脫脂奶粉（TBST配制）封閉1.5h后，IDO抗體按1∶1 000的比例與封閉液混合，4℃過夜孵育電轉(zhuǎn)膜，TBST洗滌3次后，加入HPR標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1∶2 000），室溫?fù)u床振蕩1h，TBST洗滌3次，加入ECL發(fā)光液后用X光片曝光。

1.4 RT－PCR檢測(cè)細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子（suppress of cytokine signaling，SOCS）的轉(zhuǎn)錄 采用2mmol／L NaB和100U／mL IFN－γ同時(shí)處理CNE2細(xì)胞6h，Trizol抽提總RNA；42℃60min，95℃5min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，94℃變性5min，94℃變性30s，SOCS1 44℃、SOCS3 51℃ 退火30s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，終止反應(yīng)，進(jìn)行PCR反應(yīng)（表1）。

1.5 Real time PCR 檢測(cè)干擾素調(diào)節(jié)因子－1（interferon regulatory factor－1，IRF－1）的轉(zhuǎn)錄水平 取2mmol／L NaB，100U／mL IFN－γ單獨(dú)或同時(shí)處理CNE2細(xì)胞6h后，Trizol抽提總RNA；42℃60min，95℃5min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；用25μL標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系檢測(cè)IRF－1的轉(zhuǎn)錄，25μL標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Green 12.5μL，PCR Forward Primer（10μmol／L）1 μL，PCR Reverse Primer（10μmol／L）1μL，DNA 模板 1～5 μL，加H2O到25μL。采用兩步法進(jìn)行Real time PCR反應(yīng)：步驟1：95℃30s，步驟2：95℃5 10s，60℃40s40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后分析Real time PCR的擴(kuò)增曲線、融解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。IRF－1引物F：ATG GCT GGG ACA TCA ACA AGG，R：CAT GGC ACA GCG AAA GTT GG。

表1 檢測(cè)SOCS1和SOCS3轉(zhuǎn)錄的引物

2 結(jié) 果

Western blot和RT－PCR檢測(cè)NaB對(duì)CNE2細(xì)胞IDO、SOCS1、SOCS3轉(zhuǎn)錄的影響（圖1～3）。結(jié)果顯示SOCS1和SOCS3的轉(zhuǎn)錄沒有顯著變化。提示兩者未參與NaB抑制IDO表達(dá)的信號(hào)傳導(dǎo)。NaB抑制IRF－1的轉(zhuǎn)錄，間接影響IDO的表達(dá)，見圖4。

圖1 Western－blot檢測(cè)結(jié)果NaB對(duì)CNE2細(xì)胞IDO表達(dá)的影響

圖2 RT－PCR檢測(cè)NaB及IFN－γ對(duì)CNE2細(xì)胞內(nèi)SOCS1轉(zhuǎn)錄的影響

圖3 RT－PCR檢測(cè)NaB及IFN－γ對(duì)CNE2細(xì)胞內(nèi)SOCS3轉(zhuǎn)錄的影響

圖4 Real time PCR檢測(cè)NaB及IFN－γ對(duì)CNE2細(xì)胞內(nèi)IRF1轉(zhuǎn)錄的影響

3 討 論

NaB是由厭氧菌分解發(fā)酵結(jié)腸中未經(jīng)小腸消化的食物中的糖類（主要是纖維和蛋白）產(chǎn)生的，是結(jié)腸上皮細(xì)胞主要的能量來(lái)源，能刺激結(jié)腸肽或生長(zhǎng)因子的釋放，調(diào)節(jié)結(jié)腸黏膜血供，促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖［6］。近來(lái)發(fā)現(xiàn)NaB能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化、促進(jìn)凋亡的作用。NaB通過抑制組蛋白去乙酰化酶活性，導(dǎo)致組蛋白（非H1組蛋白H3、H4）高乙酰化，使組蛋白與相鄰DNA的接觸受抑制，改變了染色質(zhì)的緊密結(jié)合，有利于轉(zhuǎn)錄因子激活特異性的基因，細(xì)胞分裂周期被阻滯于G1期，而達(dá)到NaB抗腫瘤的作用［7－8］。本研究發(fā)現(xiàn)NaB抑制IFN－γ誘導(dǎo)的IDO的表達(dá)。

IFN－γ調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄主要是通過Jak－STAT信號(hào)通路，其中有50多種細(xì)胞調(diào)節(jié)因子參與［9－10］。在IFN－γ未結(jié)合其受體時(shí)，IFN－γR1和IFN－γR2可能沒有密切的聯(lián)系。然而，最近研究發(fā)現(xiàn)在配體結(jié)合之前，IFN－γR1和IFN－γR2是裝配好的。當(dāng)IFN－γ與其受體結(jié)合后，受體的胞內(nèi)區(qū)開放，Jak2自身磷酸化，然后磷酸化激活Jak1，兩個(gè)Jak1可以形成一個(gè)招募STAT1同源二聚體的槽，STAT1二聚體接著被Jak2磷酸化，磷酸化后的STAT1二聚體從受體上脫離下來(lái)。IFN－γ激活其受體到STAT1二聚體從受體上脫離這一過程只需要1min就完成了。STAT1二聚體進(jìn)入核內(nèi)結(jié)合啟動(dòng)子，誘導(dǎo)或抑制IFN－γ調(diào)節(jié)的基因。STAT1結(jié)合的元件有GAS和ISRE。IFN－γ誘導(dǎo)的第一批基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生在15～30min之內(nèi)。許多IFN－γ誘導(dǎo)基因是細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，它們由IFN－γ誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，接著調(diào)節(jié)下一批基因的轉(zhuǎn)錄［11－12］。

細(xì)胞因子是一類由細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖的多肽小分子，它們不能直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，而是通過細(xì)胞因子受體介導(dǎo)，經(jīng)相應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。SOCS是信號(hào)傳導(dǎo)通路JAK／STAT（Janus kinase／signal transduction and activators of transcription）的一個(gè)負(fù)性調(diào)控分子家族。SOCS家族有8個(gè)成員，每個(gè)成員都有一個(gè)中央SH2域，除了通常的蛋白質(zhì)降解的泛素化機(jī)制，SOCS1和SOCS3能直接抑制JAK的酪氨酸激酶活性。

干擾素調(diào)節(jié)因子－1（IRF－1）是IFN－γ調(diào)節(jié)IDO表達(dá)通路上的關(guān)鍵因子，IRF－1通過IRF－E位調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，IRF－E位的序列重疊于ISR－E的序列，此序列被ISGF3識(shí)別，其被Ⅰ型、Ⅱ型IFN－γ誘導(dǎo)［13］。在本研究采用Real time－PCR檢測(cè)了NaB和（或）IFN－γ作用下IRF－1的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)IFN－γ作用下IRF－1的轉(zhuǎn)錄水平顯著增高，而NaB有效阻斷了IRF－1的轉(zhuǎn)錄，結(jié)果提示NaB對(duì)IFN－γ調(diào)節(jié)IDO表達(dá)抑制，可能是通過抑制IFN－γ的下游信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

本研究證明了NaB通過抑制IRF－1的轉(zhuǎn)錄，從而抑制IDO表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，為其在鼻咽癌治療的應(yīng)用中提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為以IDO為靶點(diǎn)的鼻咽癌的免疫治療提供一種新的策略。

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