絲裂霉素C對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞TGF－β和Smads表達(dá)的影響

孫 奎，吳曉明，張鴻霞，許新華，王鶴鵬，楊景哲，李樹松

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形外科，河北承德067000）

瘢痕疙瘩是皮膚損傷后傷口愈合過程中出現(xiàn)成纖維細(xì)胞過度增殖、膠原大量沉積，也是皮膚損傷后組織異常修復(fù)的結(jié)果。目前，對瘢痕發(fā)生的機(jī)制仍知之甚少，因而臨床上亦遠(yuǎn)未找到切實有效的防治措施。瘢痕疙瘩多采用局部藥物注射、壓迫治療、手術(shù)和激光治療等進(jìn)行綜合治療，但效果不是很理想，因而瘢痕疙瘩也成了當(dāng)今整形外科領(lǐng)域的一個研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)[1]?，F(xiàn)將絲裂霉素C（mitomycin C，MMC）對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（keloid fibroblast，KFB）轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor－β，TGF－β）／Smads通路作用及機(jī)制報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年6月至2010年6月本院收治的瘢痕疙瘩進(jìn)行整形手術(shù)的患者13例，其中，男9例，女4例；年齡12～46歲。取材部位：上肢5例，面部3例，軀干5例。入選標(biāo)準(zhǔn)為病程短且生長活躍的瘢痕疙瘩組織，未接受任何抑制瘢痕增生的治療，均無系統(tǒng)性疾病史，且對所取組織均知情同意。

1.2 標(biāo)本的制作 將手術(shù)切下的瘢痕疙瘩組織采用組織塊貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行體外培養(yǎng)。在無菌條件下切除表皮及皮下脂肪，將標(biāo)本制成1 mm3左右的組織塊，置于培養(yǎng)瓶中，在95%空氣、5%CO2、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)8～12 h。然后加入含15%胎牛血清的達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified eagle′s medium，DMEM）適量，繼續(xù)培養(yǎng)，3～4 d換液1次。2～3周后，原代細(xì)胞生長成單層，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶3的比例傳代培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)KFB 24 h后，吸去培養(yǎng)液和未貼壁細(xì)胞，更換含不同藥物濃度的培養(yǎng)液，實驗分為對照組和MMC干預(yù)組，正常對照組用DMEM培養(yǎng)液；MMC干預(yù)組：MMC的終末濃度分別為2.50、12.50、50.00、100.00、200.00μg／L。

1.3 TGF－β1在mRNA水平的檢測 將成纖維細(xì)胞按10 cm2／mL比例加入Trizol，用Trizol總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計（日本導(dǎo)津UV2201型）測定總RNA濃度和純度，重復(fù)測定3次，A260和A280之比值應(yīng)在118～210，計算樣品總RNA濃度。引物序列為TGF－β1cD－NA擴(kuò)增的上游引物為5′－CTG CTT CAG CTC CAC AGA GAA GA－3′，下游引物為5′－AAG TTG GCG TGG TAG CCC TT－3′，產(chǎn)物片段長度為111 bp。取1μg總RNA，加入Oligo（d T）18 Primer，70℃溫育5 min；迅速放入冰浴中，加入10 mmol／L d NTP，RNA酶抑制劑，5倍緩沖液，42℃溫育5 min；冰浴中加入5 U／μL AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，加入DEPC處理水至總體積20μL，42℃溫育60 min，70℃10 min，立置冰上，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒎磻?yīng)管置于PCR儀上，95℃預(yù)變性10 min后，進(jìn)入95℃變性1 min，50℃退火15 min，72℃延伸10 min的循環(huán)，共34次，最后72℃充分延伸10 min。反應(yīng)完成后取10μL PCR反應(yīng)液，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用PCR Marker作相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電泳完畢后在紫外熒光數(shù)字成像儀下觀察結(jié)果。以每例TGF－β1與β－actin擴(kuò)增產(chǎn)物條帶吸光度的比值作為TGF－β1mRNA的相對表達(dá)量。

1.4 Western Blot檢測Smad2／3、Smad4、Smad7蛋白 取對數(shù)生長期的KFB，以5×105／mL接種于25 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，CO2孵箱內(nèi)，10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，更換含不同藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，徹底去除上清液，加入適量細(xì)胞裂解液并加入PMSF（使PMSF終濃度為0.174 mg／mL），冰上作用40 min，12 000 r／min，4℃離心20 min，取上清液，以考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。按4∶1比例加入5×Loading Buffer，封好EP管口，置水浴箱中變性5 min，進(jìn)行穩(wěn)壓電泳，以2 m A／cm2恒流 轉(zhuǎn) 膜，β－actin 4℃轉(zhuǎn) 膜2 h，Smad2／3、Smad4、Smad7 4℃轉(zhuǎn)膜3 h。2.5%封閉液配制抗體稀釋液，Smad2／3、Smad4及Smad7 1∶1 000稀釋，β－actin 1∶1 000稀釋。將聚偏二氟乙烯（PVDF）膜置于雜交袋中，加適量的抗體稀釋液于PVDF膜上有蛋白的一面，壓緊四角。4℃孵育過夜。TBST液洗膜后，加適量的抗體稀釋液于PVDF膜上有蛋白的一面，室溫作用2 h，TBST液洗PVDF膜后，暗室曝光，10 s～3 min，常規(guī)方法顯影、定影，直至顯影出電泳帶，拍照的圖像用灰度掃描軟件BandScan 4.5進(jìn)行掃描，取得目的條帶灰度值，用該灰度值和內(nèi)參β－actin灰度值相比，用相對灰度值在Excel中作圖分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，進(jìn)行方差分析，組間比較采用LSD－t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

不同濃度的MMC對TGF－β1mRNA表達(dá)，對照組和2.50、12.50、50.00、100.00、200.00μg／L的MMC干預(yù)組的TGF－β1mRNA相對表達(dá)量分別為0.88±0.07、0.80±0.06、0.51±0.04、0.47±0.05、0.36±0.03和0.22±0.02。MMC干預(yù)組TGF－β1mRNA相對表達(dá)量明顯低于正常對照組，見圖1～2。兩組Smad2／3、Smad4、Smad7蛋白的表達(dá)見表1。

表1 兩組Smad2／3、Smad4、Smad7蛋白的表達(dá)（±s，n＝13）

表1 兩組Smad2／3、Smad4、Smad7蛋白的表達(dá)（±s，n＝13）

－：表示無數(shù)據(jù)。

組別 MMC濃度（g／L）Smad2／3 Smad4 Smad7對照組－0.11±0.02 0.34±0.04 0.04±0.01干預(yù)組 2.50 0.10±0.04 0.40±0.03 0.06±0.02 12.50 0.10±0.02 0.36±0.08 0.10±0.03 50.00 0.08±0.02 0.33±0.10 0.18±0.08 100.00 0.06±0.01 0.36±0.03 0.21±0.10 200.00 0.05±0.02 0.39±0.03 0.36±0.17

圖1 TGF－β1mRNA對KFB的表達(dá)

圖2 MMC對Smad2／3、Smad 4、Smad7 β－actin蛋白的表達(dá)

3 討 論

MMC是一種抗腫瘤藥物，還是一種強(qiáng)有力的抑制成纖維細(xì)胞增殖的藥物。MMC在耳鼻喉科、眼科、神經(jīng)外科等領(lǐng)域中治療組織粘連比較廣泛，但在治療瘢痕增生的臨床及基礎(chǔ)研究較少。研究表明，MMC對KFB增殖有抑制作用，使細(xì)胞周期停滯于G1／S期而實現(xiàn)[2]，并有時間依從性，同時與劑量密切相關(guān)[3]。有研究表明，手術(shù)切除瘢痕疙瘩后，局部使用絲裂霉素取得了滿意的臨床效果[4]。于冬梅等[5]研究表明，MMC對體外培養(yǎng)KFB增殖的抑制作用與藥物濃度、處理時間有關(guān)。劉鶯等[6]通過MTT檢測證實100μg／L MMC對KFB的增殖抑制效果為最佳，為該藥物臨床應(yīng)用提供了有力的實驗依據(jù)。

TGF－β1是目前公認(rèn)的與瘢痕疙瘩形成最為密切的細(xì)胞因子[7]。TGF－β家族成員對表皮細(xì)胞的生長、分化、凋亡及腫瘤形成具有調(diào)控作用[8]。TGF－β細(xì)胞表面受體主要分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。其中TGF－β1直接刺激血管生成，刺激FB增殖及細(xì)胞中葡萄糖與氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和糖酵解的進(jìn)行，同時也抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性和促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑纖溶酶原激活物抑制劑－1基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解；還介導(dǎo)血小板源性生長因子、結(jié)締組織生長因子的致纖維化作用[9]；促進(jìn)纖維粘連蛋白和膠原基質(zhì)的黏附，促進(jìn)瘢痕的形成。陳偉等[10]研究發(fā)現(xiàn)，TGF－β1的存在會不斷刺激KFB誘導(dǎo)基質(zhì)產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞基質(zhì)的過度沉積。曹艷杰等[11]研究發(fā)現(xiàn)，丹參涂膜劑可改善增生期瘢痕微循環(huán)局部缺氧狀態(tài)，進(jìn)而抑制瘢痕組織內(nèi)細(xì)胞因子TGF－β1的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)組較對照組TGF－β1m RNA降低，隨作用時間增加TGF－β1mRNA表達(dá)變化越為明顯，在處理72 h后TGF－β1m RNA表達(dá)變化最為明顯，不同濃度MMC作用下TGF－β1m RNA表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示MMC可能通過減少TGF－β1表達(dá)，從而起到抑制瘢痕增生的作用。

TGF－β信號主要由Smad家族介導(dǎo)，其作為配體形成受體復(fù)合物，激活Smad，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)與TGF－β誘導(dǎo)基因的特定序列直接結(jié)合，共同激活或抑制其調(diào)節(jié)的靶基因轉(zhuǎn)錄[12]。Smad家族作為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)TGF－β下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，在瘢痕疙瘩的發(fā)生、發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能，Smad蛋白分成R－Smad、Co－Smad和I－Smad 3個亞家族。受體激活型或通路特異性主要包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8。共同通路型主要是Smad4，其不能與TGF－β受體相互作用，但它可以與磷酸化的R－Smads相互作用形成穩(wěn)定的異源三聚體[13－14]。抑制型包括Smad6和Smad7，它們主要通過競爭性地與激活的Ⅰ型體結(jié)合抑制R－Smads的磷酸化作用，ISmads作為一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)信號調(diào)節(jié)TGF－β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[15]。TGF－β／Smad信號通路是通過正、負(fù)反饋的調(diào)節(jié)通路自我調(diào)控的，一方面，Smad2／3發(fā)揮正反饋調(diào)節(jié)作用；另一方面，Smad7與激活的TGF－β1型受體結(jié)合，阻止R－Smad磷酸化，阻斷信號的傳導(dǎo)。已有研究表明，5－氟尿嘧啶（5－FU）有可能提高抑制型Smad（Smad6和Smad7）在胞質(zhì)中的表達(dá)，使Smad3免受磷酸化，進(jìn)而減少Smad3、Smad4雜絡(luò)物的生成，最終阻礙信號進(jìn)一步下傳[16]。積雪草甙對增生性瘢痕內(nèi)TGF－β1m RNA有明顯的抑制作用，能提高抑制型Smad7蛋白在胞質(zhì)中的表達(dá)[17]。

本研究顯示，加入不同濃度的MMC能明顯增加KFB中Smad7蛋白的表達(dá)，減弱KFB中Smad2／3蛋白的表達(dá)，并且對KFB中Smad7蛋白的增強(qiáng)效應(yīng)強(qiáng)于對Smad2／3蛋白的減弱效應(yīng)，對Smad4蛋白的表達(dá)無變化。這可能是由于MMC通過增加Smad7蛋白的表達(dá)，通過競爭性占據(jù)TGF－β1型受體而抑制受體蛋白激酶對R－Smad（Smad2／3）的磷酸化，抑制TGF－β的病理性作用，從而達(dá)到抑制瘢痕增生的作用。

MMC依靠其強(qiáng)大的抑制成纖維細(xì)胞的功能廣泛應(yīng)用于臨床，但目前對于其治療不同類型瘢痕的方法、劑量以及不良反應(yīng)還沒有大樣本的臨床統(tǒng)計學(xué)資料。對于TGF－β／Smad信號通路作用研究獲得了迅猛發(fā)展，但仍有大量問題有待于深入研究。

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