坎地沙坦酯干預(yù)對(duì)AMI大鼠血管內(nèi)皮功能及心肌ERK、CREB mRNA的影響

高電薩，秦 儉，蘭 莉，劉春艷，陳運(yùn)貞

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院金山醫(yī)院心內(nèi)科，重慶 401122；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，重慶 400016；3.四川省綿陽市第三人民醫(yī)院心內(nèi)科 621000；4.重慶市九龍坡區(qū)第一人民醫(yī)院超聲科 400050）

內(nèi)皮功能紊亂（endothelial dysfunction，ED）在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)步驟均起著重要作用，可能與 ERK／CREB通路的改變有關(guān)［1－2］。有研究表明坎地沙坦酯（candesartan cilexetil，CAN）能保護(hù)高血壓患者和冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)后動(dòng)物的血管內(nèi)皮功能，但目前尚未見AMI后ED的發(fā)生及CAN對(duì)此的干預(yù)效應(yīng)。本文旨在探討AMI大鼠血管內(nèi)皮功能和ERK／CREB信號(hào)通路的改變及CAN干預(yù)的影響，希望能為臨床AMI患者的內(nèi)皮功能干預(yù)治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 CAN（重慶圣華曦藥業(yè)有限公司惠贈(zèng)）；鹽酸去氧腎上腺素注射液（上海禾豐制藥有限公司）；氯化乙酰膽堿（上海三愛思試劑有限公司）；亞硝基鐵氰化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）放免檢測(cè)盒（解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心）；一氧化氮（nitrous oxide，NO）檢測(cè)盒（南京建成生物科技研究所）；一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）檢測(cè)盒（南京建成生物科技研究所）；組織總RNA抽提試劑盒（上海華舜生物工程有限公司）；RT－PCR試劑盒（上海寶生物工程有限公司）；生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（型號(hào)BL－410，成都市泰盟科技有限公司）；新航肌肉張力換能器（型號(hào)JZ100，高碑店新航機(jī)電設(shè)備有限公司）；DFM－96型多管放射免疫計(jì)數(shù)器（合肥眾成機(jī)電技術(shù)公司）；721A型分光光度計(jì)（四川儀表九廠）；DYY－10C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；P×2型PCR儀（美國Thermo Hybaid公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物 健康SD大鼠30只（清潔級(jí)，雄性）。購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［體質(zhì)量（220±20）g，6～8周，許可證編號(hào)：SCXK軍2002008］。

1.2.2 造模 麻醉大鼠行氣管內(nèi)插管，呼吸機(jī)人工呼吸，于左胸3～4肋間行縱切口開胸，分離心包暴露心臟血管，用5－0號(hào)無創(chuàng)絲線對(duì)冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）進(jìn)行結(jié)扎。假手術(shù)（sham－operation，Sham）組只穿線不結(jié)扎。

1.2.3 分組及給藥方案 將術(shù)后24h存活且經(jīng)體表心電圖證實(shí)為AMI的17只大鼠隨機(jī)分為：AMI組（n＝8）和CAN組（n＝9），CAN組給藥劑量為3mg·kg－1·d－1。另設(shè)Sham組（n＝7）。研碎CAN原藥，予以0.5%羧甲基纖維素鈉助溶，配成混懸液，術(shù)后24h開始每日1次灌胃給藥，Sham組及AMI組給予等體積助溶劑灌胃，共干預(yù)2周。2周后各組存活大鼠數(shù)量分別為：Sham組6只、AMI組5只、CAN組7只。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.4.1 血壓 分別在術(shù)前、術(shù)后24h（給藥前）、1周和2周（處死前）經(jīng)大鼠尾動(dòng)脈測(cè)量收縮壓。

1.2.4.2 血清NOS、NO水平 于術(shù)后2周時(shí)經(jīng)眼眶后靜脈叢采血，分離血清，按試劑盒說明書采用化學(xué)法測(cè)定。

1.2.4.3 血漿 AngⅡ水平 采血方法同1.2.4.2，取血漿按試劑盒說明書采用放射免疫法測(cè)定。

1.2.4.4 胸主動(dòng)脈條片離體灌流實(shí)驗(yàn) 術(shù)后2周時(shí)將大鼠麻醉后開胸，迅速取出胸主動(dòng)脈約2～3cm放入Kreb′s液中，Kreb′s液進(jìn)行預(yù)冷處理并充以混合氣體（含95%O2、5%CO2），參照Gschwend等［3］的方法，分別檢測(cè)對(duì)去氧腎上腺素（phenylephrine，PE）、乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）及硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）的反應(yīng)。

1.2.4.4.1 離體胸主動(dòng)脈條片對(duì)PE的收縮反應(yīng) 計(jì)算引起最強(qiáng)收縮效應(yīng)50%的藥物濃度（EC50）和最強(qiáng)收縮效應(yīng)（Emax），同時(shí)計(jì)算不同劑量下導(dǎo)致的收縮反應(yīng)值與最強(qiáng)的收縮反應(yīng)值的百分率。PE終濃度為10－10～10－4mol／L。

1.2.4.4.2 離體胸主動(dòng)脈條片對(duì)Ach的舒張反應(yīng) 以血管條片對(duì)累積濃度Ach舒張反應(yīng)的幅度占血管條片對(duì)PE收縮幅度之比表示，同時(shí)計(jì)算引起最強(qiáng)舒張效應(yīng)50%的藥物濃度（IC50）和最強(qiáng)舒張效應(yīng)（Emax）。預(yù)收縮時(shí)所取PE濃度為10－5mol／L；Ach的終濃度為10－9～10－4mol／L。

1.2.4.4.3 離體胸主動(dòng)脈條片對(duì)SNP的舒張反應(yīng) 方法同1.2.4.4.2所述，SNP的終濃度為10－10～10－7mol／L。

1.2.4.5 測(cè)算MI面積 將AMI組和CAN組大鼠的左室橫切面制成石蠟切片后使用HE染色，制備病理切片。測(cè)量大鼠左室橫截面的內(nèi)外周長和梗死區(qū)心肌的瘢痕組織弧長。

1.2.4.6 心肌ERK1mRNA、CREB mRNA 表達(dá)的檢測(cè) 于術(shù)后2周麻醉大鼠后開胸，迅速將左心室分離，取梗死區(qū)心肌組織，以 RT－PCR法檢測(cè) ERK1mRNA、CREB mRNA的表達(dá)。表達(dá)水平以目的基因與內(nèi)參的電泳條帶吸光面積積分比值表示。反應(yīng)條件如下：ERK1引物序列：上游：ATC TCT GCT GCT GTG TCT TT，下游：ATG TTC TGT CAG GGA AAA TG，產(chǎn)物長度為180bp，退火溫度為55℃；CREB引物序列：上游：TAC CCA GGG AGG AGC AAT ACA，下游：GGT GCT GTG CGA ATC TGG TAT，產(chǎn)物長度為219bp，退火溫度為52℃；GAPDH引物序列：上游：AAT GCA TCC TGC ACC ACC AA，下游：GTA GCC ATA TTC ATT GTC ATA，產(chǎn)物長度為515bp，退火溫度為55℃。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS8.2軟件進(jìn)行分析處理，數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較均采用成組設(shè)計(jì)方差分析，多重比較采用SNK－q檢驗(yàn)。血壓比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血壓 在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠的收縮壓進(jìn)行組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)前Sham組、AMI組和CAN組收縮壓分別為（110.00±10.00）mm Hg、（110.80±11.45）mm Hg和（102.70±11.39）mm Hg，術(shù)后2周分別為（105.00±8.66）mm Hg、（108.60±11.39）mm Hg和（105.00±10.40）mm Hg。

2.2 血清NO、NOS、血漿AngⅡ水平 與Sham組比較，AMI組血清NO、NOS水平明顯降低，經(jīng)CAN干預(yù)后，NO、NOS明顯升高，并恢復(fù)至Sham組水平。AMI組和CAN組血漿AngⅡ水平較Sham組均明顯升高；CAN組水平較AMI組顯著增高（表1）。

表1 3組大鼠血NO、NOS、AngⅡ水平比較

表1 3組大鼠血NO、NOS、AngⅡ水平比較

▲：P＜0.05，與Sham組比較；★：P＜0.05，與AMI組比較。

組別 n NO（μmol／L） NOS（U／mL） AngⅡ（pg／mL）Sham組6 55.69±10.40 23.80±5.36 181.39±32.70 AMI組 5 24.46±3.95▲ 10.92±5.96▲ 281.14±84.90▲CAN 組 7 43.69±13.32 17.74±3.97 388.27±83.24▲★

2.3 胸主動(dòng)脈條片離體灌流實(shí)驗(yàn)

2.3.1 胸主動(dòng)脈條片對(duì)PE的反應(yīng) 各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。AMI組、Sham組和CAN組的EC50分別為（7.70±0.01）×10－8、（6.98±0.02）×10－8和（7.51±0.02）×10－8mol／L。見圖1。

圖1 主動(dòng)脈條片對(duì)PE的收縮反應(yīng)

2.3.2 胸主動(dòng)脈條片對(duì)Ach的舒張反應(yīng) AMI組較Sham組明顯減弱，CAN組較AMI組顯著改善，但較Sham組仍然減退。Sham組、AMI組和CAN組的IC50分別為（6.15±0.03）×10－8、（4.45±0.21）×10－7和（2.32±1.22）×10－7mol／L，見圖2。

圖2 主動(dòng)脈條片對(duì)Ach的舒張反應(yīng)

圖3 主動(dòng)脈條片對(duì)SNP的舒張反應(yīng)

圖4 AMI組梗死區(qū)影像學(xué)表現(xiàn)（HE，×100）

圖5 CAN組梗死區(qū)影像學(xué)表現(xiàn)（HE，×100）

表2 3組心肌梗死面積及ERK、CREB mRNA表達(dá)的比較

表2 3組心肌梗死面積及ERK、CREB mRNA表達(dá)的比較

▲：P＜0.05，與Sham組比較；★：P＜0.05，與AMI組比較。

組別 n 心肌梗死面積（%）ERK mRNA CREB mRNA Sham組6 0 0.51±0.09 0.40±0.19 AMI組 5 20.68±1.29▲ 1.23±0.22▲ 1.15±0.30▲CAN組 7 13.23±1.02▲★ 0.83±0.19▲★ 0.87±0.20▲★

2.3.3 胸主動(dòng)脈條片對(duì)SNP的舒張反應(yīng)比較 各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Sham組、AMI組、CAN組的IC50分別為（8.40±0.00）×10－10、（1.50±0.00）×10－9和（1.27±0.00）×10－9mol／L。見圖3。

2.4 心肌梗死面積比較 經(jīng)CAN干預(yù)后，心肌梗死面積顯著縮小。與Sham組比較，ERK、CREB mRNA在AMI組的表達(dá)明顯增加，CAN顯著抑制該表達(dá)。見表2、圖4～5。

3 討 論

ED廣泛存在于冠心病AMI病程發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)，內(nèi)皮依賴性舒張（EDD）功能異常為其特征。本實(shí)驗(yàn)采用健康SD大鼠，通過結(jié)扎冠脈LAD制作AMI模型，結(jié)果顯示，與Sham組比較，AMI組大鼠血清NOS活性、NO水平均顯著降低，而血漿AngⅡ水平顯著升高，同時(shí)，AMI組離體主動(dòng)脈對(duì)Ach的EDD反應(yīng)明顯減弱，表明AMI導(dǎo)致了ED的發(fā)生。本研究同時(shí)還顯示，與Sham組比較，AMI后2周大鼠離體血管條片對(duì)PE的收縮反應(yīng)和對(duì)SNP的非內(nèi)皮依賴性舒張（nonendothelium－dependent diastole，NEDD）反應(yīng)均無顯著性差異，表明AMI后2周血管平滑肌功能尚無明顯變化。

CAN是臨床上常用的ARB之一，能高度選擇性地阻止AngⅡ與ATlR的結(jié)合，從而拮抗AngⅡ?qū)π难芟到y(tǒng)的不良后果。目前已證實(shí)此藥穩(wěn)定、有效的降壓作用，且可顯著改善冠脈內(nèi)皮功能障礙患者［4］和冠脈支架植入術(shù)后豬EDD功能［5］，對(duì)抗動(dòng)脈硬化的進(jìn)展［6］，而有關(guān)此藥對(duì)AMI后血管內(nèi)皮功能的保護(hù)作用如何目前尚未見報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，與AMI組比較，CAN干預(yù)后，血清NOS活性及NO水平顯著增高，離體胸主動(dòng)脈條片EDD顯著改善（P均＜0.05），心肌梗死面積減小。與Sham組比較，CAN組血清NO、NOS水平差異無顯著性。換言之，CAN顯著改善后的內(nèi)皮功能與Sham組相似。已有研究證實(shí)AT1R阻斷后可反饋性升高內(nèi)源性AngⅡ水平，這與本研究結(jié)果一致，表現(xiàn)為CAN組血漿AngⅡ水平較其他兩組明顯升高。這可能與AT1R阻斷后AT2R活化，從而介導(dǎo)血管舒張效應(yīng)有關(guān)。在AT2R高表達(dá)的血管平滑肌細(xì)胞中，血管緊張素誘導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)依賴于緩激肽2型受體和NO／cGMP系統(tǒng)［7］，表明緩激肽依賴性血流量介導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)是通過活化AT2R途徑實(shí)現(xiàn)的［8］。簡言之，CAN因高度選擇性地阻斷了AngⅡ與AT1R的結(jié)合，致血中AngⅡ水平反饋性升高，大量游離的AngⅡ與AT2R結(jié)合，激活緩激肽－NO級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而使NOS活性增加，促進(jìn)NO生成［9］。

目前，對(duì)ED發(fā)生的相關(guān)信號(hào)通路尚無定論，但有研究表明ERK／CREB可能與ED發(fā)生有關(guān)。就CAN對(duì)ERK／CREB通路的影響效應(yīng)，已有研究表明它可顯著抑制由AngⅡ?qū)е碌募?xì)胞ERK活化［10］，但有關(guān)它在AMI后對(duì)ERK／CREB表達(dá)的影響效應(yīng)目前尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與AMI組比較，CAN能顯著性抑制AMI大鼠心肌ERK mRNA、CREB mRNA的表達(dá)，故推測(cè)CAN可能通過阻斷AT1R而抑制ERK／CERB基因水平的活化，從而發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗血管重塑等有害效應(yīng)，達(dá)到保護(hù)內(nèi)皮功能和縮小心肌梗死面積的作用。

與Perrone－Filardi等［11］的結(jié)果一致，在本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用劑量范圍內(nèi)，各組尾動(dòng)脈收縮壓比較無顯著性差異，表明CAN對(duì)AMI后血管內(nèi)皮功能的保護(hù)效應(yīng)獨(dú)立于降血壓效應(yīng)外。進(jìn)一步研究AMI發(fā)生ED的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及CAN改善ED的分子機(jī)制，將為臨床更好地防治冠心病及發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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