不同填料固相小柱對多烯紫杉醇血漿樣品萃取回收率的影響

王 杰 ，余 瑜

（重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 400016）

多烯紫杉醇（docetaxe1）為一類半合成的紫杉醇類抗腫瘤藥，它作用于細(xì)胞微管蛋白，抑制細(xì)胞有絲分裂而發(fā)揮抗腫瘤作用，是現(xiàn)有藥物中治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌（MBC）和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）最有效的單劑化療藥物［1］。目前，有關(guān)多烯紫杉醇及其相關(guān)制劑在生物體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究已經(jīng)在國內(nèi)外得到了較為廣泛的開展［2－5］。本實驗采用固相萃取法（SPE），選擇不同的固相填料，對多烯紫杉醇血漿樣品進(jìn)行前處理研究，考察最適合的固相萃取條件。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；GL－88B型旋渦混合器（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；PB602－E電子分析天平（瑞士梅特勒－托利多上海公司）；DCY－16S型氮吹儀（青島?？苾x器有限公司）；TGL－16G臺式高速離心劑（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Waters Oasis HLB柱（美國 Waters公司），Sep－pak vac c18小柱（美國Waters公司），Strata小柱（美國Phenomenex公司）。

多烯紫杉醇購自中國藥品生物制品檢定所（批號：10666－201002，純度大于或等于99.5%），紫杉醇購自中國藥品生物制品檢定所（批號：10382－200301，純度大于或等于99.5%），甲醇、乙腈為分析級色譜純（阿達(dá)瑪斯公司），實驗用水為高純水。

1.2 色譜條件 Phenomenex LUNA C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司）；流動相為甲醇－乙腈－水（42∶26∶32，v／v／v）；流速：1.0mL／min；檢測波長：230nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。

1.3 固相萃取小柱洗脫條件考察

1.3.1 溶液的配制 分別取多烯紫杉醇對照品及內(nèi)標(biāo)紫杉醇適量，精密稱定，用流動相稀釋成濃度均為0.1g／L的多烯紫杉醇對照液及紫杉醇內(nèi)標(biāo)溶；空白人血漿稀釋成多烯紫杉醇和內(nèi)標(biāo)紫杉醇濃度分別為0.05g／L和0.02g／L的樣品液；另外采用純甲醇和高純水分別配制成濃度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70% 、80%及 90% 的 甲 醇 溶 液 。

1.3.2 血漿樣品的固相萃取 將Waters Oasis HLB小柱用1 mL甲醇活化，1mL水平衡，加入1.3.1項下的樣品液1mL，用水分別預(yù)洗3次（A1～A3），每次1mL，棄去預(yù)洗液，再用1 mL乙腈洗脫（A4）；另取 Waters Oasis HLB小柱10支，分別用1mL甲醇活化，1mL水平衡，加入上述樣品液1mL，分別用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的甲醇各2mL進(jìn)行洗脫（B1～B10），洗脫液用40℃氮氣吹干，1mL流動相重新溶解后0.45μm微孔濾膜過濾。分別取20μL按上述HPLC色譜條件進(jìn)樣分析。

1.4 不同填料固相小柱的萃取效率 取1.3.1項制備的多烯紫杉醇對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，用空白人血漿稀釋成多烯紫杉醇低、中、高濃度分別為0.1、1.0、10.0μg／mL的血漿樣品溶液（內(nèi)標(biāo)紫杉醇濃度均為1μg／mL），每個濃度5份，用水稀釋1倍，作為樣品液。對 Waters Oasis HLB小柱，Waters Seppak vac C18小柱及Strata C18－E小柱進(jìn)行比較。分別用1mL甲醇活化上述固相小柱，1mL水平衡，加入多烯紫杉醇血漿樣品液，分別用1mL水預(yù)洗3次，棄去預(yù)洗液，2mL甲醇洗脫，收集洗脫液，40℃氮氣吹干，適量流動相重新溶解，0.45μm微孔濾膜過濾。取20μL按上述高效液相色譜法（HPLC）條件進(jìn)行分析，得多烯紫杉醇與內(nèi)標(biāo)紫杉醇峰面積比為A1。

另取1mL高純水代替人血漿配制低、中、高3個濃度為0.1、1.0、10.0μg／mL的多烯紫杉醇對照品溶液（內(nèi)標(biāo)紫杉醇濃度均為1μg／mL），不經(jīng)萃取，按上述HPLC色譜條件進(jìn)樣20μL分析，得多烯紫杉醇與內(nèi)標(biāo)紫杉醇峰面積比為A2，按下式計算：回收率（%）＝（A1／A2）×100%。

2 結(jié) 果

2.1 血漿樣品固相萃取洗脫條件考察 采用 Waters Oasis HLB小柱為固相填料，以不同濃度的甲醇以及純乙腈作為洗脫劑時，結(jié)果見表1。從表1可知，采用Waters Oasis HLB小柱為固相填料，最大可用甲醇清洗的濃度為60%，而最小洗脫濃度為80%，乙腈的洗脫能力與甲醇相差不大?？紤]價格因素，故以純甲醇進(jìn)行洗脫。

表1 多烯紫杉醇和內(nèi)標(biāo)紫杉醇的清洗洗脫比較

圖1 空白血漿HPLC色譜圖

2.2 不同填料固相小柱的萃取效率 不同填料固相小柱對多西紫杉醇的萃取回收率見表2，HPLC色譜圖見圖1和圖2。由表2可知，當(dāng)以Waters Oasis HLB小柱為固相填料進(jìn)行多烯紫杉醇的血漿樣品萃取時，萃取回收率在95%～105%，RSD平均值為4.26%，適合用于血漿中多烯紫杉醇的測定。使用該小柱的回收率和精密度均高于另外2種固相小柱。

表2 不同填料固相小柱的萃取回收率（%，n＝5）

圖2 空白血漿加多烯紫杉醇和內(nèi)標(biāo)HPLC色譜圖

3 討 論

血漿由于含有膽紅素而呈淡黃色液體，是血液的重要組成部分；血漿的化學(xué)成分中，水分占90%～92%，其他10%以溶質(zhì)血漿蛋白為主，并含有電解質(zhì)、營養(yǎng)素、酶類、激素類、膽固醇和其他重要組成部分。多烯紫杉醇為白色結(jié)晶性粉末，易溶于有機(jī)溶劑。多烯紫杉醇血漿樣品的前處理是體內(nèi)藥物分析工作的關(guān)鍵步驟，直接影響整個測定的準(zhǔn)確性［6－7］。樣品預(yù)處理技術(shù)——固相萃取是由液固萃取和柱液相色譜技術(shù)相結(jié)合，主要用于樣品的分離、純化和濃縮；與液－液萃取法相比，可以更有效地分離分析物與干擾組分，減少樣品預(yù)處理過程，從而分析物的回收率［8－9］。固相萃取技術(shù)建立在液－固相色譜理論，采用選擇性吸附和洗脫的方式對樣品進(jìn)行富集、分離和純化，利用選擇性吸附與洗脫的分離原理［10－11］。常用方法先讓液體樣品通過吸附劑（保留其中被測物質(zhì)），之后選用適當(dāng)強度溶劑除去雜質(zhì)，最后用少量溶劑洗脫出被測物質(zhì)，達(dá)到快速分離凈化與濃縮的目的［12－13］。固相萃取作為樣品前處理技術(shù)，在實驗室中得到了越來越廣泛的應(yīng)用［14－15］。

固相萃取主要分為3類：正相固相萃取、反相固相萃取和離子交換固相萃取。正相固相萃取所用的吸附劑都是極性的，主要取決于目標(biāo)化合物的極性官能團(tuán)與吸附劑表面的極性官能團(tuán)之間相互作用，其中包括了氫鍵和π－π鍵的相互作用、偶極－偶極相互作用和偶極－誘導(dǎo)偶極相互作用以及其他的極性－極性作用；反相固相萃取所用的吸附劑和目標(biāo)化合物通常是非極性的或極性較弱的，主要是靠范德華力或色散力（非極性－非極性相互作用）；離子交換固相萃取是靠目標(biāo)化合物與吸附劑之間的相互作用是靜電吸引力。Waters Oasis HLB小柱的填料是由親脂性二乙烯苯和親水性N－乙烯基吡咯烷酮2種單體按一定比例聚合成而成，吸附容量高，批次間重現(xiàn)性好；美國Phenomenex公司的Strata C18－E小柱的填料是高度疏水的十八烷基鍵合硅膠基質(zhì)端基封尾鍵合相；美國waters sep－pak vac C18小柱的填料是十八烷基鍵合硅膠。HLB小柱的另一優(yōu)點是柱床干涸對提取影響不大，而另2種小柱在樣品上樣前，柱床不能干涸，否則需重新活化。

本研究表明，使用 Waters Oasis HLB小柱為固相填料進(jìn)行多烯紫杉醇的血漿樣品萃取，比使用其他2種填料更加適合用于血漿中多烯紫杉醇的測定。

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