MicroRNA－144在結(jié)腸癌中的表達水平及臨床意義

張廣鈺，鐘 漓，田小林，戴 凌，朱襲嘉，蔣志慶

（桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院胃腸外科，廣西 桂林 541001）

結(jié)腸癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展是多基因相關、多步驟的，尋找結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的誘導和促進基因，為結(jié)腸癌的診斷、治療及其預后提供理論支持［1］。成為關注熱點的microRNA作為一種非編碼小分子RNA，具有廣泛調(diào)節(jié)基因表達的功能，參與細胞增殖、分化、凋亡等多種重要細胞活動的調(diào)控［2］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)microRNA具有癌基因和抑癌基因的作用，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［3－4］。本文通過逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量聚合酶鏈反應（real－time reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－qPCR）檢測38例結(jié)腸癌中microRNA－144的表達水平，探討其與結(jié)腸癌及其臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 桂林醫(yī)學院2011年6月至2012年4月實施手術(shù)治療的結(jié)腸癌患者38例，其中，男21例，女17例，患者中位年齡59歲，術(shù)前未行放、化療等治療，組織病理類型的判斷標準參照WHO病理分期標準。每例標本留取腫瘤組織及對應7cm以上的癌旁正常結(jié)腸黏膜組織，每例都經(jīng)病理切片檢查證實，離體后5min內(nèi)置于液氮中保存。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Oligo dT、dNTPs、SYBR Mastermix等購自Takara公司；引物由上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 RNA提取 取液氮保存的結(jié)腸癌組織及癌旁正常結(jié)腸黏膜組織標本，在液氮中碾碎至粉末，加1mL Trizol裂解10 min收集上清液于EP管中，加氯仿200μL充分混勻，12 000 r／min離心15min，取上清200μL轉(zhuǎn)移到新的去RNA酶的EP管中，加等量異丙醇顛倒混勻放置10min，12 000r／min離心10min，棄上清液加1mL 70%的乙醇顛倒混勻，12 000r／min離心10min，棄去乙醇，干燥，用DEPC處理過的蒸餾水溶解。采用日本Malcom極微量光譜光度計e－spect測所提RNA濃度，OD 260／280在1.8～2.0之間的用于檢測。

1.3 RT－qPCR體系及其反應條件 表1為所用逆轉(zhuǎn)引物的序列。按所用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書20μL的體系，1μg RNA模板分別以microRNA－144和U6（作為內(nèi)參，分析microRNA－144的表達）引物進行逆轉(zhuǎn)錄，反應條件：42℃60min。取樣進行qPCR，反應體系：1μL RT產(chǎn)物（終濃度為5ng）、2＊SYBR Green I Mastermix 12.5μL、0.5μmol／L microRNA 特異前向引物、0.5μmol／L通用的反向引物，所有樣品做3個復孔。反應條件：95℃7min后，95℃15s，60℃30s，40個循環(huán)。其余cDNA存放于－80℃超低溫冰箱。qPCR反應后隨即分別取6個樣品各1μL進行3%瓊脂糖凝膠電泳檢測目標產(chǎn)物（圖1）。Real－time定量PCR使用的Agilent Technologies stratagene Mx3005p儀器。所得Ct值，以 U6為內(nèi)參，用2－△△Ct進行分析來表示microRNA－144癌組織相對于癌旁正常組織的變化倍數(shù)。

表1 microRNA－144RT－qPCR檢測相關引物序列

圖1 qPCR產(chǎn)物電泳圖

1.4 統(tǒng)計學處理 microRNA的表達數(shù)據(jù)以中位數(shù)和95%可信區(qū)間（95%CI）表示。受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件行非參數(shù)秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)腸癌及其相應癌旁正常結(jié)腸黏膜組織中的microRNA－144的表達情況 qPCR結(jié)果顯示，內(nèi)參U6的Ct值沒有明顯變異，結(jié)腸癌組織中的microRNA－144的Ct值明顯低于相應的癌旁正常結(jié)腸黏膜組織，表明microRNA－144在結(jié)腸癌組織中表達上調(diào)。38例結(jié)腸癌患者癌組織與癌旁正常結(jié)腸黏膜組織的 microRNA－144的相對表達量 N（N＝2－△△Ct），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 microRNA－144在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達情況

2.2 結(jié)腸癌組織中microRNA－144表達與臨床病理特征的關系 結(jié)腸癌組織中microRNA－144的表達與腫瘤的分化程度相關，高分化組的表達量低于中、低分化組的表達量（P＜0.05），中分化組表達量與低分化組的表達量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；結(jié)腸癌組織中 microRNA－144的表達水平與臨床TNM分期有顯著相關性（P＜0.05），Ⅰ～Ⅱ期結(jié)腸癌組織中microRNA－144表達量低于Ⅲ～Ⅳ期（P＜0.05）；結(jié)腸癌組織中microRNA－144的表達與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況無相關性（P＞0.05）；結(jié)腸癌組織中 microRNA－144的相對表達量與其他臨床病理因素如性別、年齡、腫瘤的大小無明顯相關性（P＞0.05），見表3。

2.3 采用ROC曲線分析microRNA－144評價結(jié)腸癌細胞分化程度及TNM分期的特異性和敏感性 microRNA－144比較不同分化程度的ROC曲線下面積為0.800（95%CI＝0.661～0.939，P＝0.003），比較不同TNM分期的ROC曲線下面積為0.820（95%CI＝0.675～0.965，P＝0.001），提示 microRNA－144適合作為評價細胞分化程度和結(jié)腸癌TNM分期的判斷標準（圖2）。以microRNA－144相對表達量1.70作為評價臨界值，區(qū)分高分化結(jié)腸癌的敏感性和特異性分別為88.0%和61.5%，區(qū)分TNM分期的敏感性和特異性分別為87.5%和64.3%。

表3 結(jié)腸癌中microRNA－144表達和臨床病理因素的相關性

圖2 microRNA－144表達與結(jié)腸癌患者分化程度和TNM分期的ROC曲線

3 討 論

結(jié)腸癌是世界上第3大常見腫瘤，因結(jié)腸癌導致的死亡率排名第2位，約50%的結(jié)腸癌患者在確診時已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，是一種惡性程度非常高的腫瘤，手術(shù)治療依然是結(jié)腸癌的主要治療方式之一。隨著使用抗EGFR和抗VEGF的分子靶向治療的應用及化療的進展，晚期結(jié)腸癌患者的中位生存期已經(jīng)由6個月增高至2年［5］。隨著對結(jié)腸癌分子水平研究的深入，對microRNA在結(jié)腸癌的研究越來越多。

microRNA可調(diào)節(jié)30%的人類基因。成熟的microRNA一般有19～25個堿基，這些堿基與3′端非編碼區(qū)的mRNA（3′UTR）結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄進而影響基因的表達［6］。目前，已有研究證實，microRNA通過參于基因調(diào)控影響蛋白表達水平而影響結(jié)腸癌的進展，而且，不同的microRNA在結(jié)腸癌的作用不同，甚至相同的microRNA在不同類型的結(jié)腸癌中的表達也不相同，有些microRNA充當癌基因作用，有些microRNA充當抑癌基因的作用［7］。microRNA在許多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)有過表達，如乳腺癌、腦癌、肺癌、胰腺癌、甲狀腺癌等［7］。microRNA－144在結(jié)腸癌患者的糞便和血液中高表達［8－9］，然而其在結(jié)腸癌患者組織中的表達情況國內(nèi)外尚沒有文獻報道，因此本課題選microRNA－144作為研究對象。本研究顯示，microRNA－144在結(jié)腸癌組織中的表達量明顯增高，在分析microRNA－144表達與結(jié)腸癌臨床病理因素的相關性中發(fā)現(xiàn)，microRNA－144表達水平與結(jié)腸癌組織的分化程度相關，而且與結(jié)腸癌腫瘤患者的TNM分期相關。microRNA－144在中低分化組中的表達水平高于高分化組，提示microRNA－144主要在結(jié)腸癌的進展階段起作用，而在結(jié)腸癌的發(fā)生起始階段可能以其他因素起作用為主。進一步的ROC曲線分析顯示，microRNA－144高分化結(jié)腸癌的敏感性和特異性分別為88%和61.5%（圖2）。因此，microRNA－144可以作為結(jié)腸癌腫瘤分化程度的一個輔助診斷標準。

microRNA－144可作為結(jié)腸癌腫瘤分化程度的一種輔助指標，其表達量的上調(diào)在診斷結(jié)腸癌的分化程度方面有較高的敏感性。本研究與大部分研究結(jié)果一致，目前發(fā)現(xiàn)有35種microRNA在結(jié)腸癌中有表達量的改變。然而，對于microRNA在腫瘤中的表達有一些截然不同的觀點，有些microRNA發(fā)現(xiàn)與分化程度呈正相關，而同樣關于該microRNA的研究則發(fā)現(xiàn)與分化程度呈負相關，有學者認為這主要是因為在體內(nèi)的位置不同所致，也有研究發(fā)現(xiàn)在不同位置很少同時檢測到microRNA升高［9］。本研究表明，不同的分化程度、不同的臨床TNM分期均對microRNA－144產(chǎn)生影響。

本實驗結(jié)果顯示，microRNA－144在結(jié)腸癌組織中的表達量高于正常的結(jié)腸癌組織中的表達量，且隨著TNM分期而發(fā)生改變，提示microRNA可作為一種腫瘤的進展指標。有學者曾作過該方面的研究，其機制為microRNA導致腫瘤癌基因或抑癌基因發(fā)生了轉(zhuǎn)化［10］。但本研究對腫瘤的進展未作進一步深入研究。對microRNA作為一種臨床治療效果預測的分子標志，有許多研究曾報道［11］。本研究組目前對microRNA－144過表達患者的臨床治療效果以及預后情況正在作進一步研究。

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