錦州地區(qū)腹瀉住院兒童星狀病毒檢測及同源性分析

王 文，牛 科，闞麗麗，張尚松，杜海婷，趙 微遼寧醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物教研室，遼寧錦州 000；遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧錦州 000；盤錦市遼河油田總醫(yī)院，遼寧盤錦 4000

星狀病毒(human astrovirus，HAstV)是一種無包膜單股正鏈RNA病毒，現(xiàn)已知有8個(gè)傳統(tǒng)的血清型HAstV 1~8和多種新的亞型，如MLB1、AV1、HMO A~C等[1-7]。HAstV-Ⅰ型在全世界范圍流行。是引起嬰幼兒、老年人和免疫缺陷患者病毒性胃腸炎的重要病原體，也是健康成人發(fā)生胃腸炎的病因之一，發(fā)病率僅次于輪狀病毒(rotavirus，RV)[8-9]。我國星狀病毒腹瀉的研究、監(jiān)測和控制工作起步較晚，缺乏相關(guān)的系統(tǒng)性研究，而錦州市也未曾開展過相關(guān)的專題調(diào)查研究。為了解錦州市地區(qū)腹瀉住院兒童星狀病毒感染狀況，本實(shí)驗(yàn)于2011年10月-2012年3月收集了錦州地區(qū)三家醫(yī)院住院腹瀉兒童糞便標(biāo)本235份，進(jìn)行星狀病毒核苷酸檢測和序列測定，并與國內(nèi)外常見的星狀病毒參考株核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析，以確證病原體和分析其基因特征。

材料和方法

1 樣本來源 收集2011年10月-2012年3月錦州市附屬一院、錦州市婦嬰醫(yī)院、錦州市中心醫(yī)院兒科住院腹瀉患兒糞便標(biāo)本235份，患兒年齡2~5歲，發(fā)?。? d，每日排便＞3次，且大便性狀為水樣稀便，大便常規(guī)檢測無膿細(xì)胞及血細(xì)胞。樣本采用PBS溶液(NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO410 mmol/L，KH2PO42 mmol/L，pH 7.2~7.4)進(jìn)行1∶5稀釋，劇烈漩渦震蕩后離心，收集上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 病毒基因組RNA提取及HAstV基因擴(kuò)增 采用TRziol試劑(invitrogen公司)提取糞便上清液中的病毒RNA。采用RT-PCR法擴(kuò)增HAstV基因。星狀病毒檢測引物如表1所示，引物由上海生工生物有限公司合成。分別以下游引物Mon348、Mon270作為反轉(zhuǎn)錄引物，采用大連寶生物公司的MMLV RTase cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行第一鏈cDNA合成。以上述cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，第一次PCR反應(yīng)條件為：95 ℃，5 min預(yù)變性 ；95 ℃ 30 s，50 ℃30 s，72 ℃ 50 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后延伸10 min，擴(kuò)增星狀病毒ORF1a保守區(qū)。第二次PCR反應(yīng)中退火溫度為55 ℃，其余條件相同。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測。Taq DNA 聚合酶、dNTP等PCR反應(yīng)試劑購自大連寶生物公司。

表1 星狀病毒檢測引物

3 序列測定及遺傳進(jìn)化分析 經(jīng)電泳檢測的PCR陽性產(chǎn)物克隆至PMD-18T載體，進(jìn)行核酸序列測定，測序由上海生工生物有限公司完成。測序結(jié)果與GenBank中的HAstV基因進(jìn)行序列BLAST比較分析。使用clustal8.0和MEGA4軟件的鄰近法建立遺傳進(jìn)化樹。

結(jié) 果

1 RT-PCR結(jié)果及感染陽性率 利用Mon340和Mon348對(duì)235份糞便標(biāo)本進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，檢測到星狀病毒陽性29份，擴(kuò)增產(chǎn)物289 bp(圖1)，陽性率為12.3%。擴(kuò)增的陽性29份樣本采用Mon269和Mon270引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，所有樣本均檢測到450 bp的目的條帶(圖2)，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖 1 部分陽性樣本第一次RT-PCR檢測結(jié)果泳道1-16為部分樣本擴(kuò)增結(jié)果， 泳道M為100 bp marker

圖 2 部分陽性樣本第二次PCR檢測結(jié)果泳道1-11為部分樣本擴(kuò)增結(jié)果， 泳道M為DL2000 marker

2 多序列對(duì)比分析 擴(kuò)增的29份陽性樣本中，我們選擇了檢出信號(hào)較強(qiáng)的5份進(jìn)行測序分析，分別命名為jinzhou-1、jinzhou-2、jinzhou-3、jinzhou-4、jinzhou-5。經(jīng)過核酸相似性分析，5個(gè)樣本序列測序結(jié)果之間核苷酸相似性和氨基酸相似性均為99%。我們采用ORF2衣殼蛋白基因，基于348 bp進(jìn)行不同國家地域星狀病毒序列的多序列對(duì)比分析，結(jié)果表明：本實(shí)驗(yàn)分離的毒株與文獻(xiàn)報(bào)道的我國北京、武漢、大連、沈陽毒株核酸相似性均在89%~90%，而與美國毒株3085/1999、哥倫比亞毒株COL359、德國毒株AC10BR/2005、巴西毒株RJ8408、西班牙毒株Bcn1.5核酸相似性高達(dá)96%~97%，提示本研究分離到的星狀病毒毒株在遺傳進(jìn)化上可能與我國已報(bào)道的毒株具有一定差異性。

3 遺傳進(jìn)化分析 以擴(kuò)增的ORF2區(qū)序列348 bp為標(biāo)準(zhǔn)，采用Neighbour-joining法構(gòu)建進(jìn)化樹，并進(jìn)行l(wèi)ineage分類。本研究中分離到的毒株屬于HAstV-1型1d亞型，與本研究室前期在兒童暴發(fā)腹瀉糞便樣本中分離的星狀病毒Astro-CHN/LiaoNing毒株(結(jié)果尚未發(fā)表)相似性達(dá)到98%，屬于同一個(gè)基因型和lineage。而與我國目前已經(jīng)分離的星狀病毒毒株不屬于一個(gè)亞型，見圖3。

圖 3 HAstV基于ORF2基因348bp核酸序列的遺傳進(jìn)化分析

討 論

星狀病毒誘導(dǎo)的病毒性胃腸炎在世界范圍內(nèi)普遍流行，感染率通常為2%~9%[10-12]。國外文獻(xiàn)報(bào)道HAstV在兒童住院腹瀉病例中的檢出率為0.6%~14%[7]。中國部分地區(qū)腹瀉患兒中星狀病毒的感染率為8.7%~16.6%，而本研究HAstV檢出率為12.3%(29/235)[13]。

本研究采用兩側(cè)RT-PCR檢測星狀病毒感染，第一次采用星狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ORF1a作為擴(kuò)增引物，該區(qū)域在所有星狀病毒亞型中高度保守，可以擴(kuò)增所有星狀病毒亞型，以免出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象[14]。第二次采用星狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白ORF2 N端區(qū)域作為擴(kuò)增區(qū)域，ORF2為病毒衣殼蛋白，其N端序列可以作為不同星狀病毒亞型分型的依據(jù)，用來確定星狀病毒的型別[15]。本研究采用兩次PCR進(jìn)行擴(kuò)增，避免了漏檢及出現(xiàn)假陰性結(jié)果，大大提高了病毒檢出的特異性和準(zhǔn)確性。但本研究中所用的引物不能擴(kuò)增新型星狀病毒亞型如MLB型、 VA型、HMOAstV型，樣本中是否存在新型星狀病毒亞型感染還尚未確定。

根據(jù)星狀病毒衣殼蛋白ORF2序列的348 bp分型序列的變異情況，可以對(duì)同一個(gè)型別的星狀病毒毒株進(jìn)行l(wèi)ineage劃分，將該區(qū)域序列的變異性在7%以內(nèi)的劃分為同一個(gè)lineage。根據(jù)這個(gè)原則，HAstV-1分為6個(gè)lineage(lineage 1a~1f)。根據(jù)國內(nèi)報(bào)道過的HAstV-1 lineage，中國地區(qū)流行的HAstV-1 均以lineage 1b為主。而本研究中分離的HAstV-1為lineage 1d，與我國武漢和北京分離的HAstV-1流行毒株不屬于同一個(gè)lineage，這有可能與不同的地域差異及樣本采集當(dāng)時(shí)流行的毒株特點(diǎn)有關(guān)[16-17]。

本研究通過對(duì)2011年10月-2012年3月錦州市三家醫(yī)院病毒性腹瀉病原學(xué)情況進(jìn)行檢測，初步分析和總結(jié)了錦州市病毒性腹瀉實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測數(shù)據(jù)及病毒病原的構(gòu)成，為今后研究星狀病毒的分子流行病學(xué)，探討病毒起源、變異、進(jìn)化途徑等提供了依據(jù)。

1 Madeley CR， Cosgrove BP. Letter： 28 nm particles in faeces in infantile gastroenteritis［J］. Lancet， 1975， 2（7932）： 451-452.

2 De Benedictis P， Schultz-Cherry S， Burnham A， et al. Astrovirus infections in humans and animals - molecular biology， genetic diversity， and interspecies transmissions［J］. Infect Genet Evol，2011， 11（7）： 1529-1544.

3 Finkbeiner SR， Le BM， Holtz LR， et al. Detection of newly described astrovirus MLB1 in stool samples from children［J］. Emerg Infect Dis， 2009， 15（3）： 441-444.

4 Finkbeiner SR， Li Y， Ruone S， et al. Identification of a novel astrovirus （astrovirus VA1） associated with an outbreak of acute gastroenteritis［J］. J Virol， 2009， 83（20）： 10836-10839.

5 Finkbeiner SR， Holtz LR， Jiang Y， et al. Human stool contains a previously unrecognized diversity of novel astroviruses［J］. Virol J，2009， 6：161.

6 Glass RI， Noel J， Mitchell D， et al. The changing epidemiology of astrovirus-associated gastroenteritis： a review［J］. Arch Virol Suppl， 1996， 12：287-300.

7 Kapoor A， Li L， Victoria J， et al. Multiple novel astrovirus species in human stool［J］. J Gen Virol， 2009， 90（Pt 12）： 2965-2972.

8 Fields BN， Knipe DM， Howley PM， et al. Fields virology［M］. 3rd.Philadelphia：Lippincott-Raven Publishers， 811-824.

9 Giordano MO， Martinez LC， Rinaldi D， et al. Diarrhea and enteric emerging viruses in HIV-infected patients［J］. AIDS Res Hum Retroviruses， 1999， 15（16）：1427-1432.

10 Resque HR， Munford V， Castilho JG， et al. Molecular characterization of astrovirus in stool samples from children in S?o Paulo， Brazil［J］. Mem Inst Oswaldo Cruz， 2007， 102（8）： 969-974.

11 Chen SY， Chang YC， Lee YS， et al. Molecular epidemiology and clinical manifestations of viral gastroenteritis in hospitalized pediatric patients in Northern Taiwan［J］. J Clin Microbiol， 2007， 45（6）：2054-2057.

12 Guix S， Caballero S， Villena C， et al. Molecular epidemiology of astrovirus infection in Barcelona， Spain［J］. J Clin Microbiol，2002， 40（1）： 133-139.

13 方肇寅，孫亞萍，葉新華，等. 中國七個(gè)地區(qū)1998-2005年急性腹瀉住院患兒中星狀病毒感染研究［J］. 中華流行病學(xué)雜志，2006，27（8）：673-676.

14 ?？疲瑔嗡?，巴彩鳳. 人星狀病毒Ⅰ型衣殼蛋白序列分析［EB/J］.http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20121126.1005.001.html

15 Dong J， Dong L， Méndez E， et al. Crystal structure of the human astrovirus capsid spike［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2011， 108（31）： 12681-12686.

16 Guo L， Xu X， Song J， et al. Molecular characterization of astrovirus infection in children with diarrhea in Beijing， 2005-2007［J］. J Med Virol， 2010， 82（3）： 415-423.

17 Liu MQ， Yang BF， Peng JS， et al. Molecular epidemiology of astrovirus infection in infants in Wuhan， China［J］. J Clin Microbiol， 2007， 45（4）： 1308-1309.