微水相酸性蛋白酶催化蔗糖乙酸酯合成研究

錢俊青，宋大威，單昱東

（浙江工業(yè)大學 藥學院，浙江 杭州 310032）

微水相酸性蛋白酶催化蔗糖乙酸酯合成研究

錢俊青，宋大威，單昱東

（浙江工業(yè)大學 藥學院，浙江 杭州 310032）

探索微水環(huán)境中酸性蛋白酶催化蔗糖和乙酸乙烯酯的酯化反應，對催化合成蔗糖乙酸酯的反應溶劑進行比較，確定四氫呋喃為較好的反應介質(zhì)，并詳細考察了該反應的參數(shù)：緩沖液pH值、含水體積分數(shù)、反應溫度以及反應時間對酯化效果的影響.確定了該酯化反應的最優(yōu)工藝條件：緩沖液pH為5.4，反應溫度為40℃，反應14 h后，每0.68 g蔗糖可制得蔗糖乙酸酯30.46 mg，蔗糖-6-乙酸酯占總酯質(zhì)量的61.58%.

酯化；酸性蛋白酶；蔗糖乙酸酯

蔗糖酯由于具有良好的乳化性、無刺激性和易降解性等優(yōu)點在醫(yī)藥、化工及食品等領域具有廣泛的用途［1－2］.目前有文獻報道，從自然界分離出的葡萄糖單元上多取代的蔗糖酯已被證實具有抗蟲和抗菌活性［3－5］，從茄科植物分離出來的蔗糖酯是煙草香味的重要來源［6］.而蔗糖酯中的蔗糖-6-乙酸酯則是合成甜味劑三氯蔗糖的重要中間體.

三氯蔗糖作為一種新型的非營養(yǎng)型甜味劑，在人體內(nèi)幾乎不被吸收，熱量值為零，是肥胖癥、心血管病和糖尿病患者理想的輔助治療產(chǎn)品，因此在醫(yī)藥中應用價值很大，市場前景較為廣闊［7－8］.目前，世界上只有英國Tate-Lyle公司和美國Johnson公司聯(lián)合實現(xiàn)了三氯蔗糖的自主工業(yè)化生產(chǎn).因此，對于合成三氯蔗糖的重要中間體蔗糖-6-乙酸酯的合成進行研究具有廣闊的應用前景［9］.又因酶法合成蔗糖酯由于其高效的結(jié)構(gòu)選擇性和條件溫和等優(yōu)點被廣泛的研究和應用［10］.因此，筆者采用酸性蛋白酶為催化劑，去探索一種合成蔗糖-6-乙酸酯的新方法.

1 實驗部分

1.1 實驗試劑與儀器

蔗糖及所有有機溶劑均為市售分析純；酸性蛋白酶，酶活5 000 U／g，湖州禮來生物技術(shù)有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀，Alltech 3300蒸發(fā)光檢測儀（ELSD）.

1.2 蔗糖乙酸酯合成方法

在50 mL的具塞磨口三角瓶中加入一定量蔗糖和酸性蛋白酶，用移液管按順序定量移入緩沖液、有機溶劑及乙酸乙烯酯，并置于搖床內(nèi)震蕩反應，反應結(jié)束后反應液用偏氟乙烯微孔濾膜濾去懸浮酶顆粒等雜質(zhì)，HPLC-ELSD進行定量分析，每組實驗做三個平行.

1.3 產(chǎn)物定量分析方法

色譜條件：流動相：0.1%醋酸水溶液，流速0.8 mL／min，柱溫30℃，進樣量2μL.蒸發(fā)光檢測器溫度85℃，氮氣流速1.5 L／min.產(chǎn)物結(jié)構(gòu)通過標樣出峰時間和液質(zhì)聯(lián)用分子量大小確定.產(chǎn)物定量分析可以通過色譜峰面積歸一法，計算出產(chǎn)物生成量［10］.

2 結(jié)果與討論

2.1 純有機相反應

在50 mL的具塞磨口三角瓶中加入蔗糖0.68 g、丙酮、異丙醇、四氫呋喃、叔丁醇和叔戊醇等五種有機溶劑各10 mL，以及乙酸乙烯酯1.80 mL和酸性蛋白酶0.04 g置于40℃搖床內(nèi)反應12 h后，對產(chǎn)物進行分析，發(fā)現(xiàn)酸性蛋白酶在純有機溶劑中不表現(xiàn)出活性，沒有得到酯化產(chǎn)物.

2.2 加入少量緩沖液對酯化反應的影響

在2.1反應條件基礎上，加入0.40 mL（占體系總體積的4%）0.20 mol／L的醋酸鈉－醋酸緩沖液，并加入一組有四氫呋喃但不加酶其他條件相同的平行樣做比較進行反應，經(jīng)分析后所得酯化產(chǎn)物情況如圖1所示，只有四氫呋喃作為有機溶劑體系時，才產(chǎn)生了6位蔗糖乙酸酯，酸性脂肪酶表現(xiàn)出了6位蔗糖乙酸酯結(jié)構(gòu)選擇專一性.這一現(xiàn)象可能是由于溶劑的結(jié)構(gòu)和疏水性等理化性質(zhì)的不同，使酶和底物的結(jié)合形成中間態(tài)的取向不同，導致不同?；稽c的暴露而產(chǎn)生了選擇差異性.

2.3 體系中緩沖液體積分數(shù)對酯化效果影響

圖1 加入緩沖液后各有機溶劑中總酯及6位酯產(chǎn)量Fig.1 Effect of organic solvent with buffer on the enzymatic synthesis of sucrose esters

實驗中加入占反應體系一定百分體積含量的去離子水或者pH為5.4，濃度為0.20 mol／L的醋酸鈉－醋酸緩沖液來考察體系中緩沖液體積分數(shù)對產(chǎn)物的影響，總酯產(chǎn)量以及蔗糖-6-乙酸酯選擇性見圖2，在總酯產(chǎn)量上，酸性蛋白酶的緩沖液體系始終高于去離子水體系，這是因為去離子水無法提供酸性環(huán)境.綜合總酯轉(zhuǎn)化率及蔗糖-6-乙酸酯選擇性考慮，當加入原體系體積3%的醋酸鈉－醋酸緩沖液時，其產(chǎn)物量最多，酯化效果最好.

圖2 體系中水和緩沖液體積分數(shù)酯化反應的影響Fig.2 Effect of buffer volume ratio on the enzymatic synthesis of sucrose esters

2.4 緩沖液pH值對酯化反應的影響

在2.3反應條件基礎上，選取不同pH的0.20 mol／L的醋酸鈉－醋酸緩沖液0.3 mL（占體系總體積的3%）加入到四氫呋喃反應體系中，反應結(jié)束后，總酯產(chǎn)量以及蔗糖-6-乙酸酯選擇性見圖3.結(jié)果顯示總酯產(chǎn)量隨著pH值的增大而增大，當緩沖液pH值為5.4時總酯產(chǎn)量達到最高，當pH值大于5.4后，總酯產(chǎn)量有較顯著的下降；蔗糖-6-乙酸酯選擇性則隨著pH值的增加而上下波動，但變化不大.綜合各個因素考慮，選擇最適pH為5.4.

2.5 反應溫度對酯化效果影響

溫度是影響酶促反應的重要因素，過高過低的溫度會改變酶分子構(gòu)象，影響到酶的催化活性.實驗結(jié)果如圖4所示，當溫度低于40℃時，反應速率隨著溫度的升高而增加，當超過40℃時，酯化反應效果及選擇性出現(xiàn)明顯下降，當溫度達到50℃時，酸性蛋白酶已無法選擇性合成蔗糖-6-乙酸酯.因此，選擇酯化反應最佳溫度為40℃.

圖3 醋酸鈉－醋酸緩沖液中pH對酯化反應的影響Fig.3 Effect of initial pH of buffer on the enzymatic synthesis of sucrose esters

圖4 反應溫度對酯化反應的影響Fig.4 Effect of temperature on the enzymatic synthesis of sucrose esters

2.6 酯化反應進程

圖5 時間對酯化反應的影響Fig.5 Effect of time on the enzymatic synthesis of sucrose esters

酶催化酯化反應是一類可逆反應，在一定時間內(nèi)隨著反應的進行酯化率逐漸增加，當體系達到動態(tài)平衡后，酯化率也達到平衡值.實驗結(jié)果如圖5所示，當反應時間在14 h，總酯轉(zhuǎn)化率達到最高，而6位酯的產(chǎn)量隨著時間上下波動，變化不大，得出最佳酯化反應時間為14 h.可制得蔗糖乙酸酯30.46 mg，蔗糖-6-乙酸酯占總酯質(zhì)量的61.58%.

3 結(jié) 論

提出了全新的微水相環(huán)境下四氫呋喃／緩沖液反應體系，應用于酸性蛋白酶催化蔗糖和乙酸乙烯酯的酯化反應.探索出不同有機溶劑及各工藝參數(shù)對反應的影響，使得酸性蛋白酶的酯化能力和選擇性有了更好的提高.為后續(xù)的蔗糖-6-乙酸酯合成研究提供了科學依據(jù).同時，隨著蔗糖酯產(chǎn)品的需求量逐年增加，蛋白酶催化合成蔗糖酯將更會具有越來越大的科學研究和實際應用價值.

［1］林秀杰，薛桂芬.蔗糖酯的合成與應用研究進展［J］.化工縱橫，2001（2）：10-12.

［2］李祖義，徐國梁，袁長貴，等.生物表面活性劑催化合成蔗糖酯及其應用［J］.上海化工，1999，24（21）：6-9.

［3］FERRER M，SOLIVERI J，PLOU FJ，et al.Synthesis of sugar esters in solvent mixtures by lipases from Thermomyces lanuginosus and Candida antarctica B，and their antimicrobial properties［J］.Enzym and Micro Tech，2005，36：391-398.

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［5］OVENDEN S P B，YU Jin，BERNAYS J，et al.Physaloside a，an acylated sucrose ester from pHysalis viscose［J］.J Nat Prod，2005，68：282-284.

［6］SEVERSON R F，ARRENDALE R F，CHORTYK O T，et al.Isolation and characterization of the sucrose esters of the cuticular waxes of green tobacco leaf［J］.J Agric Food Chem，1985，33：870-875.

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［10］羅旭，錢俊青.叔丁醇體系中脂肪酶催化合成蔗糖乙酸酯［J］.高校化學工程學報2010，24（3）：451-454.

The research of the synthesis of sucrose acetata catalyzed with acid protease in micro-aqueous

QIAN Jun-qing，SONG Da-wei，SHAN Yu-dong
（College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

In order to explore the esterification between vinylacetate and sucrose catalysed by acid protease in trace water system，in this resarch，various reaction solvents were screened，and finally the Tetrahdrofuran was selected as the best solvent.The effects of the reaction parameters were investigated and the optimum operation conditions are obtained as follows：buffer pH＝5.4，V（water）∶V（Tetrahdrofuran）＝3%，reaction temperature of 40 ℃.Under the optimum conditions mentioned above，every 0.68 g sucrose can introduce 30.46 mg sucrose acetate after 14 h，the selectivity of 6-sucrose acetate reached 61.58%.

esterification；acid protease；sucrose acetate

Q814.9

A

1006-4303（2013）02-0119-03

2012-02-16

國家863科技項目（2006AA10Z311）

錢俊青（1964—），男，浙江紹興人，教授，博士，研究方向為天然藥物，E-mail：qjq＠zjut.edu.cn.

（

陳石平）