GDNF在大鼠急性脊髓損傷中的表達及變化規(guī)律

周成福,南 鵬,馬曉茹

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院骨外科,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學基礎醫(yī)學院,黑龍江 佳木斯 154007)

膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell linederived neurot rophic factor,GDNF)由 Lin等在1993年從大鼠神經(jīng)膠質細胞系 B49的培養(yǎng)液中首先純化并命名[1]。研究表明,GDNF是近年來發(fā)現(xiàn)的一種屬于轉化生長因子β且超家族成員的新型神經(jīng)營養(yǎng)因子,最近己發(fā)現(xiàn)其對培養(yǎng)的 DA神經(jīng)元、脊髓和周圍運動神經(jīng)元、交感覺神經(jīng)元等多種神經(jīng)元都具有促進生長及保護作用,是目前發(fā)現(xiàn)的活性最強的神經(jīng)元營養(yǎng)因子[2]。GDNF在大部分脊髓組織中有廣泛的分布,大多數(shù)脊髓組織中廣泛存在的膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子免疫組化檢測,可發(fā)現(xiàn)在脊髓后角中 GDN F有免疫活性。GDN F在大鼠胚與胎時期廣泛高表達于腦脊髓說明其對該類組織的發(fā)育與分化起營養(yǎng)作用,出生后在神經(jīng)組織及其靶組織表達明顯降低,成年大鼠則表達甚微。脊髓損傷后 GDNF的變化及規(guī)律沒有提出明確研究。本實驗采用免疫組化測定大鼠脊髓損傷后 0h、 2h、 12h、48h、72h脊髓組織 GDN F的含量 ,并與對照組進行比較分析,意在探討 GDN F在脊髓損傷時的動態(tài)變化并為判斷脊髓損傷提供臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

健康成年 Wistar大鼠56只(佳木斯大學動物中心飼養(yǎng),大連醫(yī)科大學購買),雌雄不限 ,體重200～300g。適應性飼養(yǎng)1周。動物室內(nèi)自然光照單獨飼養(yǎng)。室溫保持24℃,噪音 (30±15)bd,全密閉式自然排風。飼以營養(yǎng)均衡飼料,保證飲水和食物,除實驗因素外,不受其他任何不良影響。

1.2 大鼠脊髓損傷模型制作

損傷組采用改良 Allen[3]法制備大鼠脊髓損傷模型,以10%水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉(戴手套以左手食指和拇指抓住大鼠頸后皮膚比較松弛的地,大小魚際夾住大鼠尾部組織,使大鼠仰臥位選擇左下或右下腹腔進針,回抽無血后注入),給予青霉素20單位左下肢肌肉注射后,俯臥位固定與操作臺上,背部去除毛,常規(guī)術區(qū)碘伏消毒,鋪無菌單,背部正中切口 (T10～ T12),鈍性向下分離筋膜及椎旁肌肉,顯露棘突后用咬骨鉗去除棘突 ,打開椎板 ,暴露 T11、T12硬膜囊,用10g的重錘自10cm處沿瞄準器垂直打擊放置在硬模上直徑2mm的墊片上,造成外傷性脊髓損傷[4,5]見脊髓組織出現(xiàn)腫脹、出血 ,甚至斷裂,大鼠出現(xiàn)擺尾反射,雙下肢及軀體回縮撲動后自然松弛,雙后肢遲緩性癱瘓,表明撞擊成功急性脊髓損傷模型造模成功。術后清潔切口,以消毒溫鹽水沖洗損傷脊髓及創(chuàng)口后縫合肌肉,筋膜皮下組織及皮膚。清洗傷口周圍血跡,防止大鼠感染等其他不可知因數(shù),影響實驗結果。等待大鼠麻醉蘇醒后分別獨自喂養(yǎng),補充大量葡萄糖后,給予均衡飼料喂養(yǎng),清潔溫水,吹風機保暖 (大鼠在麻醉蘇醒后和高位脊髓損傷可導致致低體溫及低血壓如處理不當大鼠死亡率較高),術后蘇醒肌肉注射青霉素20單位日一次持續(xù)3d,每日溫水清洗后肢及下腹部并擦干,2～3h1次,避免感染及壞死。每日按摩膀胱促進排尿2次 ,適時更換鼠籠中的木屑[4,5]。避免動物因感染、二便障礙導致其死亡,術后3d之內(nèi)觀察大鼠的狀態(tài)如下肢活動功能進食排便,注意防止大鼠發(fā)生擠壓死亡,嚴密觀察大鼠切口,預防性擦拭碘伏。對照組采取同前方法咬開椎板后不損傷脊髓后給予縫合。

1.3 動物分組

動物隨機分為7組,正常組和假手術組,其中6組制成急性脊髓損傷模型,1組作為對照組。

1.4 標本采集,制備和保存

分別于手術后 0h、2h、 12h、 24h、 48h、 72h自背部打開椎管,顯露 T11、T12受傷脊髓,見脊髓組織腫脹出血壞死,變性如豆腐渣樣,切取損傷節(jié)段和相鄰頭尾部節(jié)段長約7mm脊髓,置于三蒸水中清洗去除血跡,后給予4%多聚甲醛緩沖液里固定 ,存放于4℃冰箱過夜,脫水,石蠟包埋,制作成標本蠟塊,冠狀面連續(xù)切片,厚度5μm。

1.5 免疫組化

每組取8張切片分別行 GDNF檢測,選擇脊髓組織完整石蠟載玻片上依次滴加一抗、二抗、三抗然后滴加顯色底物,DAB色素混合物。所用試劑和儀器為小鼠抗人 GDNF抗體、ABC試劑盒、DAB顯色劑、DAB染色劑。免疫組化檢測SABC法和 DAB染色。GT-120A全自動生物組織脫水機(上海市宇騰電子儀器有限公司);GT-100病理石蠟包埋機(上海市宇騰電子儀器有限公司);GT-98石蠟包埋冷凍機(上海市宇騰電子儀器有限公司);GT-2745A石蠟切片機;DT-90A攤烘烤片機(上海宇騰電子儀器有限公司);SIM bs-31恒溫水浴箱;Metamoph Image System(UIC,美國 )DP10/Olympus BX 51(日本)顯微攝影圖像分析系統(tǒng)。

1.6 圖像分析

光學顯微鏡100倍視野下可見正常組免疫組化切片可見脊髓后角組織中 GDNF陽性灰度值顏色淺陽性率低,假手術組可見脊髓后角灰度值及陽性率明顯增多。應用 Metamoph Image System(UIC,美國 )/DP10/Olympus BX 51(日本 )顯微攝影圖像分析系統(tǒng),400倍視野下,在損傷灶周圍距損傷區(qū)200μ m范圍內(nèi)隨機選取5個視野,對 GDNF免疫組織化學染色、原位雜交染色陽性反應物進行定量檢測,測定陽性反應物平均灰度,然后應用 SPSS軟件下進行統(tǒng)計學處理。

1.7 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采集完采用 SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析,所有實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差 (± s)表示 ,進行方差檢驗 t分析,P＜0.05表示有顯著差異。

2 結果

GDNF免疫組化染色結果:對照組及假手術組后0h組無特異陽性染色,假手術組 GDNF表達2h可見陽性率及灰度值明顯變化且陽性率達到最高值,12h、24h、48h、有所改變GDNF的表達呈現(xiàn)下降趨勢,72h幾乎接近對照組?？梢娂顾钃p傷后 GDNF的變化2h脊髓立即啟動應急措施保護損傷脊髓進行自我修復。這一變化規(guī)律可以作為臨床診斷脊髓損傷提供幫組和指導。見表1。

表1 各組大鼠不同時間點 GDN F的灰度值 (±s)

表1 各組大鼠不同時間點 GDN F的灰度值 (±s)

*具有顯著性差異 (P＜0.05)。

組別時間 0h 2h 12h 24h 48h 72h對照組 2.30± 0.29 2.27± 0.16 2.33± 0.13 2.33± 0.23 2.28± 0.15實驗組 2.33± 0.33 12.21± 0.65* 8.97± 0.59* 6.35± 0.34* 4.35± 0.34* 2.50± 0.15

3 討論

脊髓損傷是世界性難題,每年給很多家庭帶來災難性的損失經(jīng)常會導致四肢肌力下降,運動障礙,感覺過敏高位脊髓損傷甚至危及生命,而脊髓損傷的最佳治療期在受傷的48h以內(nèi)。早期的治療不論是藥物(單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂、激素)還是手術的前提必須是明確是否為脊髓損傷和損傷的時期如損傷早期大劑量激素沖擊療法和后續(xù)的單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂治療,現(xiàn)代的診療方法,包括受傷機制、體格檢查、影像學表現(xiàn)都是從各個方面來診斷脊髓損傷。帶來的是復雜、繁瑣、和不確定人為因素、價格的昂貴。我們試圖需找一種簡潔、迅速、快捷、低廉的診斷手法來解決我們我遇到的困難。如炎癥反應時白細胞應急性升高,從這一思路而來我們也尋求一種可以有通過應急反應升高的特異性物質來診斷脊髓損傷。哺乳動物脊髓損傷(Spinalcordinjury,SCI)后感覺和運動僅有非常小的機會恢復,大部分不能恢復到損傷以前,因為神經(jīng)細胞為不可再生細胞,肢體的感覺及運動有所恢復大部分了來源于膠質細胞,原因可能為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)不能提供的細胞生長的條件,致使絕大部分神經(jīng)細胞的再生面臨死亡,其中神經(jīng)營養(yǎng)因子不足以及神經(jīng)細胞的退變是不可缺少的的因素[6～8]。

哺乳動物從出生到成熟過程中,神經(jīng)細胞再起過程起到了決定性的作用,而神經(jīng)膠質細胞在維護其生長發(fā)育中充當了重要角色,他們廣泛分布于神經(jīng)周圍,通過各種渠道,按一定的復制、轉錄、翻譯,作用于特定的神經(jīng)表面決定簇,發(fā)揮其特殊作用。隨著分子生物學的發(fā)展,新的神經(jīng)營養(yǎng)因子不斷發(fā)現(xiàn),同時對它們的基因序列、分子構成、分布特點、調(diào)控機制的研究也取得一定的研究成果。大量研究表明,脊髓損傷會引起神經(jīng)化學物質的改變,諸如脊髓前動脈的改變、離子平衡的改變以及代謝改變,這些改變可以直接對神經(jīng)元和膠質細胞產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用,神經(jīng)修復重建是目前研究的重點之一。研究發(fā)現(xiàn)其與神經(jīng)痛感覺過敏有關聯(lián),對損傷導致的細胞變性壞死有促進其再生作用[9]。研究顯示,GDNF在腦缺血、帕金森氏病、肌萎縮側索硬化等原因造成的神經(jīng)損傷中具有明顯的保護作用[10]。本研究通過制備動物急性脊髓損傷模型,采用免疫組織化學方法檢測脊髓組織中不同時間點 GDN F的表達情況。正常組中可見到 GDN F在大脊髓前角后角中低水平表達;損傷后2h脊髓后角表達的GDNF達到高峰,12h后陽性率開始下降,24h、48h、持續(xù)下降,72h恢復到正常水平。GDN F通過目前我們已知和未知的方式。作用于特定相應的神經(jīng)細胞群和細胞表面相應的決定簇,發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用。神經(jīng)細胞和膠質細胞在各種營養(yǎng)因子和周圍特定的微環(huán)境發(fā)揮著修復脊髓的作用。GDNF可能通過自分泌或旁分泌方式發(fā)揮作用,因為自分泌或旁分泌在損傷和應激狀態(tài)下更具作用,為急性期脊髓損傷提供新的方法。

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