阿托伐他汀對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜核因子－κB表達(dá)的影響

魏 薇 于曉靜 王曉梅 隋 淼 朱瑞萍 李 湘

(大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 大連 116001)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病(DM)常見和嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，是DM患者的主要致盲原因。病程20年以上的DM患者中，幾乎全部的1型DM患者及60%的2型DM患者均可出現(xiàn)程度不同的視網(wǎng)膜病變〔1〕。核因子(NF)-κB作為一個(gè)具有多向性調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，對眾多調(diào)節(jié)血管病變的細(xì)胞因子、黏附因子等均有調(diào)控作用，被視為DM微血管病變的中心調(diào)節(jié)因子〔2〕。隨著對DR的深入研究，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，NF-κB 在 DR 的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用〔3，4〕。阿托伐他汀是3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑家族成員之一，近年發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物除了降血脂作用外，同時(shí)具有抗炎作用〔5〕。NF-κB的激活在DR的發(fā)生中起著重要作用。而阿托伐他汀是否可以通過抑制DM大鼠視網(wǎng)膜NF-κB的活性來改善DR，尚不清楚。本研究目的在于探討阿托伐他汀對DM大鼠視網(wǎng)膜NF-κB的表達(dá)影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型復(fù)制 健康8周齡雄性SD大鼠60只，體重200～350 g，購于大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)抽取20只做正常對照組，其余大鼠以鏈脲左菌素65 mg/kg〔6〕的劑量進(jìn)行一次進(jìn)行腹腔注射。注射后72 h，常規(guī)消毒后，取尾靜脈血少量，測量血糖，以血糖高于16.7 mmol/L〔7〕作為DM模型成功標(biāo)準(zhǔn)。成模的38只大鼠隨機(jī)分成兩組，即DM非藥物干預(yù)組及DM阿托伐他汀干預(yù)組。阿托伐他汀干預(yù)組于成模后48 h，將阿托伐他汀溶于飲用水，按照每只大鼠體重2 mg·kg－1·d－1灌胃，糖尿病非藥物干預(yù)組及正常對照組每天給予等量飲用水灌胃，共計(jì)24 w。分別于3個(gè)月和6個(gè)月藥物治療后，將3組大鼠各取8只取大鼠雙眼，一只用10%中性甲醛固定制備病理切片，另一只置于－80℃冰箱用于RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測NF-κB mRNA 半定量RT-PCR檢測NF-κB mRNA的表達(dá):大連寶生物公司進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，NF-κB上游引物5'-CACCAAAGACCCACCTCACC-3'，下游引物5'-CCGCATTCAAGTATAGTCCC-3'(產(chǎn)物260 bp)。內(nèi)參β-actin上游引物5'-CACACGCAGCTCATTG-3'，下游引物5'-AAGGACTCCTACGTTG-3'(產(chǎn)物141 bp)。用Trizol提取總RNA。PCR總反應(yīng)體系25 μl，反應(yīng)條件 NF-κB:94℃初變性 2 min，進(jìn)入循環(huán)，94℃變性30 s，59℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，35 個(gè)循環(huán)后，72℃ 延伸10 min。β-actin:94℃初變性 2 min，進(jìn)入循環(huán)，94℃變性 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 30 s，35 個(gè)循環(huán)后，72℃ 延伸 10 min。PCR產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，掃描及半定量分析。

1.2.2 免疫組化方法檢測 NF-κB表達(dá):SABC法測定，DAB顯色。檢測方法嚴(yán)格按照說明書操作。顯微鏡下控制顯色，陽性表達(dá)信號為棕黃色。PBS代替一抗做陰性對照。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取3張切片，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)200倍數(shù)高倍視野，細(xì)胞核棕黃著染者為陽性。計(jì)數(shù)標(biāo)本的陽性細(xì)胞核數(shù)量的均值為結(jié)果，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù) 采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示。多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 按照STZ 65 mg/kg進(jìn)行腹腔注射。3 d后大鼠情況為:(1)大鼠生長情況:注射后的第1天死亡2只，第3天死亡1只，第5天死亡1只。(2)STZ大鼠與正常大鼠的外觀相比，精神萎靡，行動(dòng)遲緩，皮毛潮濕，墊料潮濕。36只大鼠血糖＞16.7 mmol/L，造模成功。血糖＜16.7 mmol/L的2只大鼠，待血糖恢復(fù)后，重新給予STZ 65 mg/kg一次性腹腔注射。各組大鼠血糖情況見表1。

2.2 RT-PCR法檢測NF-κB的表達(dá) 見表2及圖1。

2.3 免疫組化結(jié)果 顯微鏡下觀察:在正常對照組3個(gè)月及正常對照組6個(gè)月，NF-κBp65在視網(wǎng)膜血管層有少許表達(dá)，在光鏡下胞核呈棕黃色。DM組3個(gè)月與正常組3個(gè)月相比NF-κBp65陽性細(xì)胞數(shù)量在視網(wǎng)膜血管層表達(dá)增加，顏色加深呈深棕色。阿托伐他汀組3個(gè)月細(xì)胞數(shù)量較DM組3個(gè)月明顯減少顏色也較其淺，但數(shù)量較正常組3個(gè)月多顏色較其深。DM6個(gè)月時(shí)，NF-κBp65陽性細(xì)胞數(shù)量在視網(wǎng)膜血管層表達(dá)最多，在節(jié)細(xì)胞層也有表達(dá)，顏色較DM 3個(gè)月組深。阿托伐他汀組6個(gè)月組細(xì)胞數(shù)量較DM 6個(gè)月組明顯減少顏色也較其淺。見表2及圖2。

表1 不同時(shí)期各組大鼠的血糖平均值(x ± s，mmol/L)

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜NF-κB mRNA的表達(dá)比值(x ± s，n=8)

圖1 PCR法檢測NF-κB mRNA表達(dá)

圖2 免疫組化圖(DAB，×200)

3 討論

DR是DM的眼部并發(fā)癥之一，周細(xì)胞的選擇性喪失是DR最早的病理改變。Romeo等〔8〕檢測DM患者血管內(nèi)凋亡的周細(xì)胞之后，發(fā)現(xiàn)激活的NF-κB在絕大多數(shù)凋亡的細(xì)胞內(nèi)都可檢測出來。NF-κB的激活是周細(xì)胞發(fā)生凋亡的信號通路的觸發(fā)點(diǎn)，在DR的發(fā)生中起著重要作用。因此，通過藥物干預(yù)的方式使NF-κB激活的各個(gè)環(huán)節(jié)受到抑制，是預(yù)防和治療DR病變的一個(gè)重要的研究方向。

3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑或他汀類，是膽固醇生成的強(qiáng)有力抑制劑，廣泛用于治療高脂血癥〔9〕。近年發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物除了降血脂作用外，同時(shí)具有抗炎作用。目前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到慢性炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮重要作用〔10〕。Bustons等〔11〕建立了家兔股動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型，經(jīng)4 w的阿托伐他汀治療，治療組家兔的血脂水平及病灶大小較非治療組明顯降低和縮小，動(dòng)脈中的巨噬細(xì)胞浸潤幾乎被清除，NF-κB表達(dá)明顯下調(diào)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，DM患者應(yīng)用阿托伐他汀治療后可以提高其內(nèi)皮的穩(wěn)定性〔12〕。有學(xué)者認(rèn)為他汀類藥物抑制NF-κB活化的可能機(jī)制是他汀類藥物抑制了p21ras途徑的DNA合成過程〔13，14〕。干擾了ras介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致NF-κB活化受到抑制。

本研究說明在大鼠眼球中，NF-κB除在視網(wǎng)膜組織有表達(dá)外，在其他的組織也有表達(dá)。由于視網(wǎng)膜組織很薄，在制作標(biāo)本過程中，染色很難操作，有的部位視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)不是很完整，可能是取材固定所致，未必是DM所致的結(jié)構(gòu)改變。本研究證實(shí)阿托伐他汀可以通過抑制NF-κB表達(dá)減輕DM大鼠視網(wǎng)膜組織的炎癥反應(yīng)，由于沒有設(shè)置不同的阿托伐他汀劑量組，尚不能證實(shí)哪種劑量更安全有效。

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