5－HT6受體在血管性癡呆大鼠海馬中的表達(dá)變化

陳小東 李 園園 劉 雁 (廣州醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣東 廣 州 5 082)

腦血管病，尤其是腦卒中后慢性腦缺血被認(rèn)為是血管性癡呆(VD)的最常見病因，其病理生理機制涉及缺血后繼發(fā)的腦能量代謝障礙、炎癥因子的瀑布效應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷、興奮性氨基酸毒性作用、膽堿能神經(jīng)元功能缺失等〔1〕。5-羥色胺(5-HT)受體家族在中樞神經(jīng)系統(tǒng)認(rèn)知、情感、攝食、晝夜周期等生理活動中具有調(diào)節(jié)作用〔2〕，其中，5-HT6受體幾乎僅分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤其以紋狀體、皮層、邊緣系統(tǒng)等腦區(qū)的分布密度高，已被證實參與大腦學(xué)習(xí)、記憶、情感等高級智能和精神活動〔3〕。本文采用大鼠永久性雙側(cè)頸總動脈阻斷模型，觀察腦缺血后海馬病理變化及CA1區(qū)5-HT6表達(dá)的改變，探討該受體與VD發(fā)病的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SPF級Wistar大鼠80只，購自南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，體重200～250 g，雌雄比例為1∶1，所有實驗大鼠飼養(yǎng)于廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院動物中心，飼養(yǎng)房內(nèi)溫度(22 ±3)℃，濕度60%，5 只/籠，光/暗周期為12 h/12 h，實驗期間自由獲取水及標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。

1.1.2 主要試劑 兔抗鼠5-HT6受體多克隆抗體購自Abcam公司，Envision二步法檢測試劑盒購自Dako公司，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑購自福州邁新生物公司，其余化學(xué)試劑均為分析純級。

1.1.3 主要儀器 Morris大鼠水迷宮，SuperMaze動物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技)，日本Olympus BX-51顯微鏡，ImagePro plus病理圖文分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制作 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后隨機分成兩組，VD組50只，假手術(shù)組(SO組)30只。動物術(shù)前禁食、禁水4 h，稱重后以10%水合氯醛按350 mg/kg體重腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定后常規(guī)消毒頸部手術(shù)區(qū)域，在頸前正中作一長約1 cm的縱形切口，鈍性分離皮下軟組織、頸前肌群，在氣管的側(cè)后方找到頸動脈鞘，分離頸總動脈與迷走神經(jīng)，以1號絲線永久性結(jié)扎頸總動脈，同法結(jié)扎另一側(cè)頸總動脈，局部消毒后恢復(fù)組織層次并縫合皮膚。SO組大鼠除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈外，其余操作與VD組大鼠一致。術(shù)后動物另放于干凈鼠籠飼養(yǎng)，自由獲取水源及飼料。

1.2.2 動物行為學(xué)觀察(Morris水迷宮實驗) 大鼠Morris水迷宮為一內(nèi)徑160 cm、高50 cm的圓形水池，水池內(nèi)壁被漆成黑色，池壁上黏貼不同形狀的空間標(biāo)記物，一個直徑為12 cm的逃生平臺固定于水池中的某一象限(即目標(biāo)象限)，進(jìn)水后水面高出平臺約1 cm，水池上方橫架安裝連接計算機顯示系統(tǒng)的攝像儀。

SO組和VD組大鼠分別在雙側(cè)頸總動脈阻斷術(shù)后4、8 w進(jìn)行 Morris水迷宮實驗，第 1 ～4 天(即 trial 1、trial 2、trial 3、trial 4)將大鼠從四個不同象限面向水池壁放入水中，大鼠找到逃生平臺后終止信息采集，最長采集時間為120 s，若超過120 s大鼠仍未能找到平臺，則將其引導(dǎo)至逃生平臺并在平臺上站立20 s以使其形成對空間參照物的記憶，每只大鼠如此訓(xùn)練4次/d，每次訓(xùn)練之間有15 s間歇以便休息，連續(xù)訓(xùn)練4 d，記錄大鼠找到平臺的逃避潛伏期評估其空間學(xué)習(xí)能力;第5天將逃生平臺從水池中撤去，將大鼠從四個不同象限投入水中，記錄60 s內(nèi)大鼠在目標(biāo)象限搜尋的時間，以此評估大鼠的空間記憶能力。每天固定在8:00～17:00進(jìn)行水迷宮實驗，實驗過程中保持房間內(nèi)光照恒定并且無光線直射于水面，水溫控制在26℃左右，迷宮外參照物保持不變。

1.2.3 組織標(biāo)本固定、制片、染色 每組各取5～6只大鼠分別在術(shù)后的相應(yīng)觀察終點麻醉動物，以4℃預(yù)冷4%多聚甲醛溶液經(jīng)心臟灌注固定，斷頭取腦后從視交叉后2～3 mm處冠狀位切取厚度約3 mm的腦組織，放入10%中性甲醛溶液中固定24 h。在自動脫水機中梯度酒精脫水、透明、浸蠟后包埋，蠟塊組織作連續(xù)冠狀切片，厚度2～3 μm。石蠟切片脫蠟、水化后分別進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色和Nissl染色，在光學(xué)顯微鏡高倍鏡(×400)下觀察海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞計數(shù)及形態(tài)。

1.2.4 免疫組化顯色分析海馬CA1區(qū)5-HT6受體的分布與表達(dá) 石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化，置于pH6.0的檸檬酸鹽中高壓修復(fù);0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次，3%過氧化氫溶液避光孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次，切片滴加兔抗鼠5-HT6受體多克隆抗體(1∶1 000稀釋)，置于濕盒內(nèi) 4℃冰箱中過夜孵育;次晨取出切片0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次，滴加葡聚糖復(fù)合物(二抗)，室溫下孵育40 min，0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次，滴加DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色合適后流水沖洗終止反應(yīng)，梯度酒精脫水、TO生物透明劑透明，中性樹膠封片后鏡檢觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，計量資料采用±s表示，兩組獨立樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多個樣本均數(shù)比較進(jìn)行Levene方差齊性檢驗，方差齊采用單向方差分析，方差不齊采用Brown-Forsythe法;平均逃避潛伏期和平均游泳速度在滿足Mauchly球?qū)ΨQ檢驗時采用單個重復(fù)測量因素的方差分析，不滿足Mauchly球?qū)ΨQ檢驗經(jīng)Huynh-Feldt系數(shù)校正自由度。

2 結(jié)果

2.1 大鼠Morris水迷宮結(jié)果 術(shù)后4、8 w，SO組和VD組大鼠在定位航行試驗中的平均游泳速度均無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。術(shù)后4 w和8 w，VD組大鼠與同時間點SO組大鼠平均逃避潛伏期比較均明顯延長(P＜0.001)，提示VD組大鼠在術(shù)后無明顯運動功能障礙，但存在空間學(xué)習(xí)能力減退，而且學(xué)習(xí)能力下降隨腦缺血時間延長加重。術(shù)后4 w空間探索試驗中，SO組和VD組大鼠目標(biāo)象限的平均搜尋時間比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001)，提示VD組大鼠空間記憶能力下降。見表 1，表 2，圖 1。

表1 假手術(shù)組和血管性癡呆組大鼠在術(shù)后4 w和8 w定位航行試驗的平均游泳速度比較(±s ，mm/s)

表1 假手術(shù)組和血管性癡呆組大鼠在術(shù)后4 w和8 w定位航行試驗的平均游泳速度比較(±s ，mm/s)

組別 Trial 1 Trial 2 Trial 3 Trial 4四次訓(xùn)練的均值SO 4 w 239.15±56.21 237.46±48.99 344.49±74.95207.85±56.31 257.24±20.92 SO 8 w 241.34±55.59 235.57±44.47 348.11±68.62 201.83±60.22 256.72±17.99 VD 4 w 264.59±93.47 269.10±65.76 232.46±59.27 201.88±32.81 242.01±26.26 VD 8 w 274.35±94.30 215.28±40.59 183.83±38.47182.42±41.01 230.69±37.96

表2 假手術(shù)組和血管性癡呆組大鼠在術(shù)后4 w和8 w定位航行試驗的平均逃避潛伏期比較(±s，s)

表2 假手術(shù)組和血管性癡呆組大鼠在術(shù)后4 w和8 w定位航行試驗的平均逃避潛伏期比較(±s，s)

與SO組同時間點比較:1)P＜0.05

組別 Trial 1 Trial 2 Trial 3 Trial 4四次訓(xùn)練的均值SO 4 w 95.41±9.94 42.41±17.81 30.06±6.42 26.58±12.78 48.62±7.99 SO 8 w 68.09±45.91 29.00±15.53 27.05±8.88 21.36±15.95 30.38±17.08 VD 4 w 99.91±11.91 89.98±8.91 85.55±18.38 75.31±8.73 87.69±7.341)VD 8 w 108.79±18.91 106.11±11.88 102.07±19.44 98.09±23.69 103.77±11.181)

2.2 VD大鼠海馬CA1區(qū)組織病理學(xué)改變 HE染色后在高倍鏡(×400)下，假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊、緊密，胞膜完整，胞核清楚;術(shù)后2 d VD組海馬CA1區(qū)未見明顯的病理變化，錐體細(xì)胞數(shù)量略減少;術(shù)后1 w VD組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列基本正常，但錐體神經(jīng)元數(shù)量減少;術(shù)后4 w VD組CA1區(qū)神經(jīng)元排列稀疏、紊亂，錐體細(xì)胞變性壞死、數(shù)量明顯減少，胞核固縮，胞漿嗜酸性;術(shù)后8 w VaD組海馬病理改變進(jìn)一步加重，神經(jīng)元細(xì)胞空泡化，錐體細(xì)胞基本消失。見圖2。

尼氏染色后在高倍鏡(×400)下，假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元胞質(zhì)中尼氏體豐富呈斑片狀;術(shù)后2 d VD組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，神經(jīng)元尼氏體未見減少;術(shù)后1 w VD組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元空泡化改變，胞漿內(nèi)尼氏體減少;術(shù)后4 w，VaD組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元固縮，細(xì)胞數(shù)明顯減少;術(shù)后8 w，VD組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元排列稀疏、紊亂，胞漿中尼氏體顯著減少。見圖3，圖4。

2.3 免疫組化分析海馬CA1區(qū)神經(jīng)元5-HT6受體表達(dá)變化與假手術(shù)組大鼠比較，VD組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元5-HT6受體在術(shù)后2 d無明顯變化，術(shù)后1 w表達(dá)略減少，在術(shù)后4～8 w亞組中表達(dá)明顯減少(P＜0.001)。見圖5，表3。

圖1 兩組大鼠在目標(biāo)象限的平均搜尋時間比較

圖2 海馬CA1區(qū)HE染色(×400)

圖3 海馬CA1區(qū)尼氏染色(×400)

表3 兩組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元免疫組化5-HT6受體平均光密度分析(±s)

表3 兩組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元免疫組化5-HT6受體平均光密度分析(±s)

與術(shù)后同時間SO組比較:1)P＜0.001

組別 SO組 VD組術(shù)后2 d 246.14±38.90 240.87±76.09術(shù)后1 w 234.59±47.31 220.53±96.34術(shù)后4 w 244.61±32.91 122.96±11.911)術(shù)后8 w 243.82±31.45 83.97±7.121)

圖4 兩組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元計數(shù)

圖5 免疫組化檢測海馬CA1區(qū)神經(jīng)元5-HT6受體平均光密度

3 討論

VD是各種腦血管因素相關(guān)病因所致腦血流循環(huán)障礙并引起與認(rèn)知相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元退行性改變、全腦功能退化的神經(jīng)退行性疾病。本文采用大鼠雙側(cè)頸總動脈阻斷模型模擬人類因慢性腦缺血、全腦低灌注所致的VD，該模型引起典型的皮層缺血性改變和皮層下白質(zhì)病變，包括白質(zhì)疏松化、脫髓鞘、膠質(zhì)增生等，與人類老齡化或腦卒中后癡呆的神經(jīng)病理改變相似，是VD的經(jīng)典動物模型〔4〕。Farkas等〔5〕指出大鼠永久性雙側(cè)頸總動脈阻斷模型術(shù)后腦血流的減少是有選擇性的，以皮層和白質(zhì)腦血流下降最為明顯，僅為正常大鼠的35% ～45%，海馬腦血流下降到正常大鼠的60%左右，術(shù)后1 w腦血流開始恢復(fù)，但4 w以后腦血流仍明顯低于正常對照的動物，術(shù)后8～12 w腦血流基本恢復(fù)到正常水平。本實驗觀察發(fā)現(xiàn)缺血急性期海馬損傷并不十分明顯，術(shù)后1～2 w可以在海馬觀察到CA1區(qū)錐體神經(jīng)元丟失、膠質(zhì)細(xì)胞激活，并且這種缺血性損害隨著腦缺血狀態(tài)的持續(xù)而進(jìn)行性加重，術(shù)后4 w海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元明顯減少，神經(jīng)元空泡樣變性，術(shù)后8 w海馬病變呈毀滅性，錐體細(xì)胞顯著減少，這與文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致〔6〕。雖然慢性缺血過程中腦血流通過側(cè)支循環(huán)重建等各種代償機制使全腦血流在8～12 w后逐漸恢復(fù)到正常水平，但低灌注對海馬造成的缺血性損害是不可逆的。實驗中術(shù)后8 w VD組大鼠在定位航行試驗中逃避潛伏期較假手術(shù)對照組明顯延長，空間探索試驗中在目標(biāo)象限的搜尋時間亦較假手術(shù)組減少，均提示海馬缺血性損傷對VD大鼠造成的空間學(xué)習(xí)、記憶能力減退的影響。一方面，海馬作為腦內(nèi)參與學(xué)習(xí)、記憶等高級智能活動的重要腦區(qū)，因其特殊的供血結(jié)構(gòu)而對缺血極為敏感，另一方面，錐體神經(jīng)元長時程增強(LTP)是記憶形成的重要神經(jīng)生理基礎(chǔ)，推測海馬慢性缺血性損傷、錐體神經(jīng)元丟失參與了VD的發(fā)病機制。

目前，已發(fā)現(xiàn)5-HT受體家族包括七種分型(5-HT1～7R)，5-HT1A、5-HT4和5-HT6受體是在多項動物實驗研究中被發(fā)現(xiàn)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶等思維活動密切相關(guān)的受體亞型〔7〕，其中，5-HT6受體幾乎僅分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而且其所分布的腦區(qū)均與人類的認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶、情感等功能相關(guān)，在腦內(nèi)與乙酰膽堿、谷氨酸、γ-氨基丁酸、腎上腺素、去甲腎上腺素等多種參與學(xué)習(xí)、記憶、情感、認(rèn)知過程的神經(jīng)遞質(zhì)均有相互作用〔3〕。在與學(xué)習(xí)、記憶密切相關(guān)的海馬，5-HT6受體主要分布在CA1區(qū)神經(jīng)元突觸后膜上?；陔p側(cè)頸總動脈阻斷后腦血流的動態(tài)改變及海馬缺血性損傷的時間特點，實驗中選擇了術(shù)后2 d、1 w、4 w、8 w作為5-HT6受體表達(dá)水平的觀察時間點。行為學(xué)觀察結(jié)果證實VD大鼠存在明顯空間學(xué)習(xí)、記憶能力缺失，且這種學(xué)習(xí)、記憶能力的減退隨腦缺血時間延長加重。結(jié)合免疫組化結(jié)果分析，VD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元上5-HT6受體的表達(dá)在腦缺血術(shù)后1 w開始下降，以術(shù)后4～8 w受體表達(dá)下調(diào)最為顯著，5-HT6受體表達(dá)的下調(diào)與動物學(xué)習(xí)、記憶功能下降的時間基本一致?；贛orris水迷宮是海馬依賴性的行為學(xué)檢測方法，因此推測VD大鼠空間學(xué)習(xí)、記憶能力減退與神經(jīng)元5-HT6受體表達(dá)改變相關(guān)。一方面，考慮到慢性缺血對海馬所造成的組織病理學(xué)改變，尤其是錐體神經(jīng)元的變性壞死、丟失，可能導(dǎo)致受體蛋白表達(dá)、合成減少;另一方面，國外研究證實拮抗5-HT6受體可以促進(jìn)腦內(nèi)乙酰膽堿釋放〔8，9〕，后者是記憶形成與維持的重要神經(jīng)遞質(zhì)，而且動物行為學(xué)研究發(fā)現(xiàn)5-HT6受體拮抗劑能提高學(xué)習(xí)、記憶、改善認(rèn)知功能〔10〕并可以逆轉(zhuǎn)由抗膽堿能藥物(如東莨菪堿)所致的記憶缺損，因此，可以推測慢性腦缺血后期5-HT6受體表達(dá)下調(diào)可能是中樞神經(jīng)對抗缺血性損傷的一種保護(hù)機制，通過受體表達(dá)下調(diào)重新調(diào)節(jié)神經(jīng)信息網(wǎng)絡(luò)中其他神經(jīng)遞質(zhì)，如乙酰膽堿、谷氨酸等的水平，從而提高中樞神經(jīng)對缺血性腦損傷后認(rèn)知功能障礙的耐受性。

綜上所述，海馬是高等動物學(xué)習(xí)、記憶過程中重要的信息整合中樞，5-HT6受體表達(dá)于海馬CA1區(qū)神經(jīng)元，拮抗該受體可以提高海馬中乙酰膽堿的水平，在發(fā)生慢性腦缺血后上述區(qū)域該受體表達(dá)隨缺血進(jìn)展而減少可能是中樞神經(jīng)信息網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)的一種代償機制。

1 Ae YLA.Vascular dementia〔J〕.Chonnam Med J，2011;47(2):66-71.

2 Filip M，Bader M.Overview on 5-HT receptors and their role in physiology and pathology of the central nervous system〔J〕.Pharmacol Rep，2009;61(5):761-77.

3 Woolley ML，Marsden CA，F(xiàn)one KC.5-HT6receptors〔J〕.Curr Drug Targets CNS Neurol Disord，2004;3(1):59-79.

4 Jiwa NS，Garrard P，Hainsworth AH.Experimental models of vascular dementia and vascular cognitive impairment:a systematic review〔J〕.J Neurochem，2010;115(4):814-28.

5 Farkas E，Luitenb PG，Bari F.Permanent，bilateral common carotid artery occlusion in the rat:A model for chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases〔J〕.Brain Res Rev，2007;54(1):162-80.

6 Woolley ML，Bentley JC，Sleight AJ，et al.A role for 5-HT(6)receptors in retention of spatial learning in the Morris water maze〔J〕.Neuropharmacology，2001;41(2):210-9.

7 King MV，Marsden CA，F(xiàn)one KC.A role for the 5-HT1A，5-HT4 and 5-HT6receptors in learning and memory〔J〕.Trends Pharmacol Sci，2008;29(9):482-92.

8 Riemer C，Borroni E，Levet-Trafit B，et al.Influence of the 5-HT6receptoron acetylcholine release in the cortex:pharmacological characterization of 4-(2-bromo-6-pyrrolidin-1-ylpyridine-4-sulfonyl)phenylamine，a potent and selective 5-HT6receptor antagonist〔J〕.J Med Chem，2003;46:1273-6.

9 Foley AG，Murphy KG，Hirst WD.The 5-HT6receptor antagonist SB-271046 reverses scopolamine-disrupted consolidation of a passive avoidance task and ameliorates spatial task deficits in aged rats〔J〕.Neuropsychopharmacology，2004;29(1):93-100.

10 Mitchell ES，Neumaier JF.5-HT6receptors:a novel target for cognitive enhancement〔J〕.Pharmacol Ther，2005;108(3):320-3.