馬鞭草醇提液對大鼠局灶性缺血再灌注后腦水腫的影響

譚文波 譚 剛

(湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

馬鞭草為馬鞭草科馬鞭草屬植物馬鞭草的全草，具有清熱解毒、通經(jīng)散瘀、利尿消腫、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)神經(jīng)生長因子介導(dǎo)的軸突生長等功效〔1，2〕。主治外感發(fā)熱、濕熱黃疸、水腫、痢疾、瘧疾、白喉、喉痹、淋病、經(jīng)閉、癥瘕、癰腫瘡毒和牙疳等〔3〕，臨床已廣泛用于抗炎抗水腫治療〔4〕。但有關(guān)其在腦缺血再灌注損傷中的抗水腫作用及其作用機(jī)制尚無報道。本文觀察本地區(qū)馬鞭草醇提液在腦缺血再灌注損傷中的的抗水腫作用，并探討其作用與AQP4的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 馬鞭草醇提液的制備:取購于恩施藥材公司的馬鞭草粗粉，乙醇回流提取3次，除去乙醇后制成濃度為1 g/ml的醇提取液 (本院中藥制劑實驗室制備);大鼠AQP4 ELISA試劑盒(購于普洛麥格生物技術(shù)有限公司)

1.2 主要實驗儀器 UV-2450分光光度儀，GL-20GⅡ型高速低溫離心機(jī)，Multikan MK3酶標(biāo)儀，BS224S電子分析天平，HFJ-10內(nèi)切式勻漿機(jī)，DW40-120低溫冰箱，XLY101恒溫烤箱。

1.3 動物分組及給藥 60只健康清潔級Wistar大鼠，體重300～350 g，雌雄不限(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物中心提供)。隨機(jī)分為假手術(shù)術(shù)后24、48、72、96 h組，模型再灌注24、48、72、96 h 組和馬鞭草再灌注24、48、72、96 h 組。每組 10 只，其中5只用于測定腦含水量，其余5只用來檢測腦組織AQP4含量。馬鞭草組術(shù)前灌服馬鞭草醇提液100 ml/kg，假手術(shù)組和模型組灌服等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥3 d，第3天給藥1 h后建立局灶性腦缺血1 h再灌注模型。

1.4 動物模型 用10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，頸部脫毛后仰臥位固定，常規(guī)消毒，頸正中切開，分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總動脈、頸外動脈，于頸總動脈分叉處插入直徑為0.26 mm的尼龍線18 mm，經(jīng)頸內(nèi)動脈、感覺有阻力即達(dá)大腦中脈起始部，完全阻斷其血流，結(jié)扎頸內(nèi)動脈。造模成功1 h后輕輕拔出栓線約1 cm，造成再灌注。假手術(shù)組僅行頸動脈剝離，不做插線處理。

1.5 腦含水量的測定 取各組大鼠剩余腦組織稱濕重后，置于85℃的烤箱中干燥至恒重后稱腦干重。按公式計算:腦水含量(%)=(腦濕重 －腦干重)/腦濕重 ×100%〔5〕。

1.6 腦組織AQP4含量的檢測 各組大鼠在相應(yīng)時間點斷頭取腦，分離出阻斷側(cè)大腦半球，稱取200 mg缺血周邊區(qū)皮質(zhì)(剩余腦組織用于檢測腦含水量)，放入勻漿器中，加入冷的生理鹽水(生理鹽水的體積總量是腦組織重量的9倍)，用內(nèi)切式勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿(10 s/次，間隙30 s，連續(xù)5～6次，在冰水中進(jìn)行)，將制備好的10%勻漿用高速低溫離心機(jī)3 000 r/min左右離心10～15 min，取0.5 ml離心好的勻漿上清液按試劑盒說明測定AQP4的含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 所有結(jié)果用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料用x±s表示，組間比較采用t檢驗，對腦組織AQP4的含量與腦含水量進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 馬鞭草醇提液對大鼠局灶性缺血再灌注損傷后腦含水量的影響 見表1。與相同時點假手術(shù)組比，模型各組大鼠腦含水量明顯增加(P＜0.01)，缺血再灌注24 h后腦含水量即逐漸增多，72 h出現(xiàn)峰值，其后緩慢下降;與相同時點模型組比，馬鞭草各組大鼠腦含水量明顯減少(P＜0.05)。

表1 馬鞭草醇提液對大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦含水量的影響(x ± s，n=5，%)

2.2 馬鞭草醇提液對大鼠局灶性缺血再灌注后腦組織AQP4含量的影響 見表2。與相同時點假手術(shù)組比，模型各組大鼠腦組織AQP4含量明顯增加(P＜0.01)，缺血再灌注24 h后腦組織AQP4的含量即逐漸增多，72 h出現(xiàn)峰值，其后緩慢下降。與相同時點模型組比，馬鞭草各組大鼠腦組織AQP4的含量明顯減少(P＜0.05)。

2.3 相關(guān)性分析 每只大鼠腦組織AQP4含量為自變量，腦含水量為因變量繪制散點圖(圖1)，結(jié)果顯示兩者呈線性關(guān)系，運(yùn)用SPSS16.0軟件對每只大鼠腦含水量與腦組織AQP4含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者呈顯著正相關(guān)(r=0.990)。

表2 馬鞭草醇提液對大鼠局灶性缺血再灌注后腦組織AQP4含量的影響(x ±s，n=5，ng/ml)

圖1 腦含水量與腦組織AQP4含量的關(guān)系

3 討論

水通道蛋白是能夠介導(dǎo)水分子自由跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的特異性水通道，目前已發(fā)現(xiàn)約10種，但腦組織中主要存在AQP1和AQP4兩種，以 AQP4含量尤為豐富〔6〕，其不僅參與維持中樞神經(jīng)內(nèi)水電解質(zhì)平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，而且還與病理過程中腦水腫及腦脊液形成與消退密切相關(guān)〔7〕。彭擁軍等〔8〕采用免疫組化ABC染色法觀測發(fā)現(xiàn)，大鼠缺血再灌注腦水腫模型缺血再灌注12 h后，在缺血周邊區(qū)AQP4蛋白的表達(dá)開始上升，隨著缺血再灌注時間的延長，AQP4表達(dá)逐漸增加，在72 h達(dá)到高峰，可在較高水平持續(xù)7 d左右，而且AQP4的表達(dá)與腦水腫的程度呈正比關(guān)系。本實驗提示AQP4與腦水腫密切相關(guān)，說明AQP4在腦水腫的形成過程中起關(guān)鍵作用。

藥理學(xué)研究表明馬鞭草具有活血化瘀、利尿消腫之功效，袁春意〔9〕用馬鞭草湯加減治療交通性腦積水30余例，均達(dá)到滿意療效。本實驗說明馬鞭草醇提液具有明顯的抗腦水腫作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制AQP4的表達(dá)，降低腦含水量來實現(xiàn)的。但其抑制腦組織AQP4表達(dá)的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

1 謝宗萬.全國中草藥匯編(上冊)〔M〕.第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:352-3.

2 肖蘇萍.沿海馬鞭草中1個新的具有促進(jìn)神經(jīng)生長因子活性的環(huán)烯醚萜糖苷〔J〕.國外醫(yī)學(xué)·中醫(yī)中藥分冊，2004;26:353.

3 金偉軍，張志東.馬鞭草的研究進(jìn)展〔J〕.時珍國醫(yī)國藥，2007;18(3):693-4.

4 陳興麗，孟 巖，張?zhí)m桐.馬鞭草化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展〔J〕.河北醫(yī)藥，2010;32(15):2089-91.

5 丁忠陽.依達(dá)拉奉對創(chuàng)傷性腦水腫大鼠AQP4表達(dá)的影響〔J〕.山東醫(yī)藥，2011;51(49):32-3.

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7 熊曉星，祝勝美，鄭躍英.腦內(nèi)AQP4表達(dá)相關(guān)研究進(jìn)展〔J〕.國際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志，2007;28(4):356-9.

8 彭擁軍，程介士，吳根誠，等.電針對腦缺血再灌注大鼠水通道蛋白-4的調(diào)節(jié)作用〔J〕.光明中醫(yī)，2009;24(1):12-5.

9 袁春意.馬鞭草妙用三則〔J〕.中國社區(qū)醫(yī)師，2006;8(131):64.