丁苯酞對大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)保護作用的研究

臧福才 唐偉 白鷹

細胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等的作用，它并不是病理條件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。本文研究丁苯酞對大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)保護作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 4-0尼龍單線。紅四氮唑，上海圣宇化工有限公司。TUNEL試劑盒，武漢博士德公司。DAB顯色試劑盒，武漢博士德公司。丁苯酞膠囊，石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2 實驗動物 健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠30只，體重280～300 g，由大連醫(yī)科大學動物室提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備 依據(jù)Nagasawa方法[1]，用10%水合氯醛（35mg/kg）行腹腔麻醉，常規(guī)備皮，頸部消毒，沿頸正中線切開皮膚，分離皮下及肌肉組織，充分暴露并分離右頸總動脈，結扎右側(cè)頸總動脈和頸外動脈，同時分離頸內(nèi)動脈，于頸總動脈分叉部橫切一小口，將頭端加熱成光滑圓球的4-0尼龍單線自切口處插入，進入大腦前動脈近端，停止推送。此時，在右側(cè)大腦中動脈起始部阻斷了來自頸內(nèi)動脈、大腦前動脈和大腦后動脈的所有血流。扎緊備線，留1.5 cm長線頭于體表，縫合創(chuàng)口。再灌注于缺血2小時后進行，輕拉尼龍線，其球端退回頸總動脈分叉處。

1.3.2 給藥方法 將丁苯酞溶解于食用油中，濃度5 mg/ml，于形成缺血再灌注后1 h時按1 ml/100 g劑量灌胃給藥。對照組給予單純的食用油，按1 ml/100 g灌胃，給藥時間同丁苯酞組。

1.3.3 分組 將30只大鼠隨機分成對照組（15只） 和丁苯酞組（15只） 。

1.4 細胞凋亡的檢測 將大鼠斷頭，取腦，于4%多聚甲醛液中固定24 h，石蠟包埋，行連續(xù)冠狀切片（片厚4 mm）；將組織切片置于染色缸中，用二甲苯洗2次，每次5 min，用無水乙醇洗兩次，每次3 min，用95%和75%乙醇各洗1次，每次3 min，PBS洗5 min 加入蛋白酶K溶液（20μg/ml），于室溫水解15 min，去除組織蛋白，蒸餾水洗4次，2min/次，色缸中加入含2%過氧化氫的PBS，于室溫反應5 min，BS洗2次，每次5 min；濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，立即在切片上加2滴 TdT酶緩沖液，置室溫1～5 min，用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體，立即在切片上滴加54 μl TdT酶反應液，置濕盒中于37 ℃反應 1 hr（注意：陰性染色對照，加不含TdT酶的反應液）；切片置于染色缸中，加入已預熱到37 ℃的洗滌與終止反應緩沖液，于37 ℃保溫30 min，每10 min將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪動；組織切片用PBS洗 3次，每次 5 min后，直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應30 min；PBS洗4次，每次5 min；組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05%DAB溶液，室溫顯色3～6 min；蒸餾水洗4次，前3次每次1 min，最后1次5 min；室溫用甲基綠進行復染10 min。用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，最后1次靜置30 s。依同樣方法再用100%正丁醇洗3次；二甲苯脫水3次，每次2 min，封片、干燥后，在光學顯微鏡下觀察并記錄實驗結果。判斷：光學顯微鏡下觀察，細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性（凋亡細胞） 。在大腦皮層梗死周圍區(qū)，隨機觀察5個高倍視野（×400），計數(shù)每個視野的陽性細胞數(shù)，取平均值。

1.5 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)使用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

丁苯酞組凋亡細胞數(shù)（20.35±4.16）個，對照組凋亡細胞數(shù)（34.90±6.10）個，丁苯酞組凋亡細胞數(shù)明顯低于對照組（P<0.05）。丁苯酞組（圖2）的神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)明顯低于對照組（圖1）。

圖1 對照組 TUNEL法（中倍放大）

圖2 丁苯酞組 TUNEL法（中倍放大）

3 討論

Kirino在腦缺血模型中首次觀察到海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞遲發(fā)死亡現(xiàn)象[2]，Du又在局灶性腦缺血模型中觀察到腦梗死形成遲發(fā)現(xiàn)象[3]，此后大量的研究表明梗死區(qū)內(nèi)遲發(fā)性細胞死亡是導致腦梗死形成遲發(fā)的主要原因[4]。隨著細胞凋亡的發(fā)現(xiàn)，人們對細胞凋亡形態(tài)、基因調(diào)控、生物化學等的逐步研究，逐漸證明了此前發(fā)現(xiàn)的遲發(fā)性細胞死亡實質(zhì)上就是細胞凋亡。在本實驗中，應用TUNEL法染色，缺血再灌注組的大腦皮層區(qū)可見大量陽性細胞，表明腦缺血再灌注后有細胞凋亡存在。

細胞凋亡是緩慢的過程，時間會被延遲幾天至十幾天[5-6]，這給治療提供了治療的時間窗，因此，拮抗凋亡成為缺血性腦血管病的治療新的靶點，成為當下人們研究關注的焦點。丁苯酞軟膠囊，商品名為恩必普，其化學名稱為消旋-3-正丁基苯酞（簡稱丁苯酞或記NBP）。為石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，是我國擁有自主知識產(chǎn)的國家一類新藥。研究表明丁苯酞可通過提高腦血管內(nèi)皮N0和PGl2的水平。降低細胞內(nèi)鈣濃度，抑制谷氨酸釋放．降低花生四烯酸含量，抑制氧自由基和提高抗氧化酶活性等機制作用于腦缺血所致的多個病理環(huán)節(jié)[7-11]。本實驗表明丁苯酞組的神經(jīng)元凋亡數(shù)明顯低于對照組，說明了丁苯酞抗凋亡的活性。為丁苯酞在臨床中的應用提供了新的有力依據(jù)。

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