巨噬細(xì)胞在混合嵌合體誘導(dǎo)異種免疫耐受中作用的實(shí)驗(yàn)研究

朱 勇 施舜繽 沈振亞

1.南通大學(xué)附屬吳江醫(yī)院胸外科，江蘇吳江 215200；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管外科，江蘇蘇州 215000

目前，由于同種器官匱乏，器官移植的數(shù)量受到限制，異種移植是器官移植目前的重要研究方向之一。遲發(fā)性異種排斥反應(yīng)（DXR）成為了異種器官移植的主要障礙[1-2]。研究表明T細(xì)胞在遲發(fā)性異種排斥反應(yīng)（DXR）中起重要作用，特別是CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)異種細(xì)胞排斥反應(yīng)尤為重要[3-4]。誘導(dǎo)免疫耐受是抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)的最理想方法。而混合性嵌合是目前比較有前景的誘導(dǎo)異種免疫耐受的策略之一[5]。在同種移植和協(xié)調(diào)性異種移植領(lǐng)域，利用混合嵌合體可誘導(dǎo)出供者特異性的免疫耐受[6]。但在非協(xié)調(diào)性異種移植供受體間，利用相同的方法卻不能獲得免疫耐受，其中原因之一就是供者骨髓細(xì)胞在受體體內(nèi)迅速消失而不能形成持續(xù)穩(wěn)定的嵌合體。有研究發(fā)現(xiàn)在比較豬-SCID/NOD小鼠（巨噬細(xì)胞功能缺陷）及豬-SCID小鼠嵌合體模型發(fā)現(xiàn)，前者的嵌合狀態(tài)維持明顯長于后者[7]。本研究在豚鼠到大鼠實(shí)驗(yàn)動物模型中，利用脂質(zhì)體包裹c(diǎn)lodronate清除受體巨噬細(xì)胞后，采用非清髓性的預(yù)處理方案誘導(dǎo)建立混合嵌合體，研究巨噬細(xì)胞在建立非協(xié)調(diào)性異種混合嵌合體中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

供體選用健康三色豚鼠，雌雄不限，受體選用健康SD雌性大鼠，體重250～300g，實(shí)驗(yàn)動物均由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SYXK（蘇）2002-0037。取7d前開始飲紅霉素（250mg/L）和慶大霉素（320mg/L）水清潔級雌性SD大鼠，（D-0）接受60Coγ射線（劑量率0.5Gy/min，總劑量5.0Gy）全身照射，照射后4h內(nèi)經(jīng)后肢隱靜脈輸注2×108/mL豚鼠BMC的細(xì)胞懸液0.8mL（24h實(shí)驗(yàn)組大鼠輸注經(jīng)CFSE標(biāo)記的豚鼠BMC細(xì)胞懸液），2d（D-2）后經(jīng)環(huán)磷酰胺預(yù)處理（腹腔內(nèi)注射CTX，50mg/kg），實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為3組，每組10例（各組5例預(yù)處理后24h處死）：A組（豚鼠BMC移植組）：僅行豚鼠BMC移植；B組（豚鼠BMC移植組+空脂質(zhì)體移植組）：BMC移植前3d經(jīng)后肢隱靜脈輸注不含clodronate空脂質(zhì)體（每天2次，每次1mL），余同A組；C組（豚鼠BMC移植組+包裹c(diǎn)lodronate脂質(zhì)體移植組）：BMC移植前3d經(jīng)后肢隱靜脈輸注含clodronate脂質(zhì)體共120mg/kg（每天2次），余同A組。

1.2 豚鼠骨髓細(xì)胞制備

將豚鼠頸椎脫臼處死后，置于75%酒精中浸泡15min，無菌條件下取股、脛骨，用RPMI 1640沖洗骨髓腔，反復(fù)吹打，分散細(xì)胞，200目鋼篩過濾制成單細(xì)胞懸液，加紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后PBS液洗2次，以RPMI 1640調(diào)整細(xì)胞濃度為2×108個/mL備用，臺盼蘭染色法判定細(xì)胞活率＞90%。

1.3 脂質(zhì)體包裹Clodronate制備

脂質(zhì)體的制備采用反相蒸發(fā)技術(shù)，即70.9mg磷酸卵磷脂、10.8mg膽固醇溶于10mL氯仿溶液中，同時加入1.8mg/mL p-aminophenyla-D-mannopyranoside甲醇溶液2mL，形成脂質(zhì)，加入10mL clodronate（10mg/mL）PBS溶液，于56℃超聲水浴10min，從而形成水包油乳劑，進(jìn)而于56℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，形成完整脂質(zhì)體?？瞻字|(zhì)體即在形成脂質(zhì)體后加入10mL PBS溶液，余同脂質(zhì)體制作。制備好脂質(zhì)體及空白脂質(zhì)體置4℃冰箱備用。

1.4 CFSE標(biāo)記豚鼠骨髓細(xì)胞及體內(nèi)追蹤檢查

活體染料羧基熒光素乙酰乙酸（carboxy fluoresceindiacetate，succinimidyl ester，CFSE） 用 DMSO 溶解成 10mmol/L 的儲存液，-20℃保存。臨用前，取適量用PBS 稀釋成5μmol/L 的工作液，平衡至室溫備用。取制備好的豚鼠骨髓細(xì)胞， 加入等體積的 CFSE 工作液（終濃度為 2.5μmol/ L） ， 充分混勻后在室溫條件下輕輕振蕩10min。然后用PBS 離心（300g，5min）洗滌細(xì)胞2 次，懸浮于含100mL/L FBS 的RPMI1640完全培養(yǎng)液中，并調(diào)整細(xì)胞密度為2×108/L。注入CFSE標(biāo)記的豚鼠骨髓細(xì)胞后1、6、12、24h分別取大鼠外周血50～100μL，裂解紅細(xì)胞后流式細(xì)胞儀檢測CFSE標(biāo)記細(xì)胞百分比。同是于24h處死受體大鼠取脾、骨髓細(xì)胞，制得單個核細(xì)胞后行流式細(xì)胞檢查CFSE標(biāo)記細(xì)胞百分比。

1.5 大鼠肝、脾CD68免疫組化檢查

CD68是巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物，本實(shí)驗(yàn)用免疫組化方法檢查。免疫組化染色采用SP法（Streptavidin-biotin immunoperoxidase method），操作步驟按說明書染色步驟進(jìn)行。

1.6 嵌合體嵌合率的測定

A、B、C組動物接受60Coγ射線全身照射后行豚鼠BMC移植，經(jīng)環(huán)磷酰胺預(yù)處理，在21d、35d取外周血檢測嵌合率。取A、B、C組大鼠的外周血離心分離得到單個核細(xì)胞，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/100μL；取上述細(xì)胞懸液100μL，加入小鼠抗豚鼠MHC Class Ⅱ抗體，混勻，避光、室溫、孵育15min；加入3mL PBS緩沖液，混勻，1500rpm離心5min，棄除上清，管底留少許液體（≤100μL）；加入1Test PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgA二抗，混勻，避光、室溫、孵育15min；加入3mL PBS緩沖液，混勻，1500rpm離心5min，棄上清，加入0.5～1mL PBS重懸，6h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測，通過細(xì)胞陽性率來檢測受體大鼠的外周血中豚鼠細(xì)胞比例。

1.7 外周血中CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞檢測

正常大鼠及實(shí)驗(yàn)組BMC移植后21d流式細(xì)胞儀檢測外周血中CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的水平。取受體大鼠外周血100μL，加入帶標(biāo)記的CD3、CD4、CD8抗體，混勻，避光、室溫、孵育15～20min后加入A液、B液和C液進(jìn)行紅細(xì)胞裂解；加入5倍以上體積PBS緩沖液，混勻，1500rpm離心5min，棄除上清，管底留少許液體（≤100μL）；加入0.5～1mL PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測。

1.8 單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（mixed lymphocyte reaction）

分別將供體（豚鼠）和受體（大鼠）脾臟制成細(xì)胞濃度為1.0×107/mL的淋巴細(xì)胞懸液。以各實(shí)驗(yàn)組SD大鼠的淋巴細(xì)胞作為MLR的反應(yīng)細(xì)胞，豚鼠淋巴細(xì)胞的作為MLR刺激細(xì)胞，刺激細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素處理；取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，設(shè)置零孔（加入RPMI 1640培養(yǎng)基150μL，不含細(xì)胞）、對照孔O組（加入正常大鼠脾細(xì)胞懸液100μL、培養(yǎng)基50μL）和待檢孔A、B、C組（每孔加入培養(yǎng)基50μL、供受體淋巴細(xì)胞懸液各50μL），每份標(biāo)本設(shè)三復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于濕度100%、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)96h后，加入CCK-8 10μL /孔；培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4h后在酶標(biāo)儀上測定OD值（選擇檢測波長450nm）。MLR的刺激效應(yīng)按照下列公式計(jì)算：刺激效應(yīng)=（實(shí)驗(yàn)組OD值－對照組OD值）/ 對照組OD值×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)均使用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)方法使用student’s t檢驗(yàn)和方差分析，數(shù)據(jù)以（± s）表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD68免疫組化檢查

預(yù)處理后第1天，C組肝臟、脾臟紅髓及紅白髓移行處巨噬細(xì)胞消失，白髓處有仍有少量CD68陽性巨噬細(xì)胞，到預(yù)處理后第21天時，肝脾中巨噬細(xì)胞已恢復(fù)與正常對照大鼠相似。而A、B兩組與正常對照大鼠相比無變化（圖1、2）。說明脂質(zhì)體包裹c(diǎn)lodronate能清除大鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞。

2.2 豚鼠骨髓細(xì)胞輸注24h內(nèi)受體外周血中豚鼠細(xì)胞比例測定

A、B、C組動物接受60Coγ射線全身照射后行經(jīng)CFSE標(biāo)記豚鼠BMC移植，移植后1、6、12、24h分別檢測大鼠外周血中CFSE標(biāo)記細(xì)胞比例，即豚鼠BMC細(xì)胞比例。在各時間點(diǎn)中，C組大鼠外周血中CFSE標(biāo)記細(xì)胞比例均明顯高于A組及B組，而A組及B組之間無顯著差異（表1），說明受體去除巨噬細(xì)胞后可提高其外周血中豚鼠BMC比例，即大鼠巨噬細(xì)胞在豚鼠BMC在其外周血中迅速消失起作用。

圖1 正常大鼠肝臟高表達(dá)CD68（光鏡×400）

圖2 正常大鼠脾臟高表達(dá)CD68（光鏡×400）

圖3 C組大鼠預(yù)處理后24h肝臟無CD68表達(dá)（光鏡×400）

圖4 C組大鼠預(yù)處理后24h脾臟CD68低表達(dá)（白髓少量表達(dá)）（光鏡×400 ）

表1 移植24h內(nèi)各時間點(diǎn)大鼠外周血中豚鼠細(xì)胞變化（± s ，%）

表1 移植24h內(nèi)各時間點(diǎn)大鼠外周血中豚鼠細(xì)胞變化（± s ，%）

注：移植后1h：與A組相比，*P=0.006；與B組相比，▲P=0.011；與A組相比，■P=0.781；移植后6h：與A組相比，*P＜0.001；與B組相比，▲P＜0.001；與A組相比，■P=0.721；移植后12h：與A組相比，*P＜0.001；與B組相比，▲P＜0.001；與A組相比，■P=0.897；移植后24h：與A組相比，*P＜0.001；與B組相比，▲P＜0.001；與A組相比，■P=0.714

組別 移植后1h 移植后6h 移植后12h 移植后24h A組 3.26±0.62 1.54±0.32 0.94±0.17 0.70±0.12 B組 3.36±0.44■ 1.46±0.25■ 0.96±0.15■ 0.74±0.11■C組 4.42±0.59*▲ 3.36±0.44*▲ 2.58±0.35*▲ 2.12±0.24*▲

2.3 豚鼠骨髓細(xì)胞輸注21d及35d嵌合率檢測

3組在21d后取外周血均檢測到一定比例的嵌合體細(xì)胞，到預(yù)處理后35d觀測發(fā)現(xiàn)嵌合率均明顯降低。流式細(xì)胞儀檢測C組嵌合率明顯高于A、B兩組（P＜0.05），A組與B組之間嵌合率無顯著差異（表2），說明去除巨噬細(xì)胞明顯提高嵌合率。

表2 受體大鼠的外周血中豚鼠源性細(xì)胞檢測結(jié)果（嵌合率）（± s ，%）

表2 受體大鼠的外周血中豚鼠源性細(xì)胞檢測結(jié)果（嵌合率）（± s ，%）

注：21d與A組相比，*P＜0.001；與B組相比，▲P＜0.001；與A組相比，■P=0.842；35d與A組相比，*P=0.002；與B組相比，▲P=0.001；與A組相比，■P=0.864

組別 預(yù)處理后21d 預(yù)處理后35d A組 3.12±0.29 0.58±0.18 B組 3.06±0.27■ 0.56±0.15■C組 5.12±0.70*▲ 1.04±0.21*▲

2.4 外周血中CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞何CD8+T細(xì)胞測定

從表3中可以看出經(jīng)輻照后T細(xì)胞亞群中CD3+T細(xì)胞比例下降，約為正常大鼠的20%；CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞亦下降，而CD3+CD4+T細(xì)胞下降幅度更大，但兩者比值對照組和各實(shí)驗(yàn)組之間無差異，與正常SD大鼠有顯著差異。

表3 各組淋巴細(xì)胞亞群（± s ，%）

表3 各組淋巴細(xì)胞亞群（± s ，%）

注：（1）CD3+T細(xì)胞：與同期正常大鼠照射組相比，*P＜0.01；對照組、A組、B組及C組組間兩兩相比，▲P＞0.05；（2）對照組即在大鼠全身照射后輸注生理鹽水，余同A組

組別 CD3+T細(xì)胞 CD3+CD4+T細(xì)胞 CD3+CD8+T細(xì)胞 CD4+/CD8+正常SD大鼠 52.28±5.61 42.46±7.42 10.88±1.72 4.08±1.40對照組 14.20±0.83*▲ 9.47±0.63*▲ 4.73±0.29*▲ 2.01±0.12*▲A組 16.34±0.75*▲ 11.08±0.51*▲ 5.26±0.33*▲ 2.11±0.11*▲B組 16.42±0.48*▲ 10.93±0.26*▲ 5.49±0.31*▲ 1.99±0.10*▲C組 17.18±0.79*▲ 11.52±0.97*▲ 5.66±0.51*▲ 2.05±0.30*▲

表4 各組刺激效應(yīng)值（100%）

2.5 單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)

經(jīng)豚鼠骨髓細(xì)胞移植3組（A、B、C組）較未行骨髓細(xì)胞移植的兩組（D、E組）的受體淋巴細(xì)胞增殖顯著減弱。其中，C組刺激效應(yīng)小于A、B兩組，A、B兩組之間刺激效應(yīng)無顯著差異，D、E兩組之間刺激效應(yīng)也無顯著差異。

3 討論

Clodronate 是一種人工合成的雙磷酸酯，脂質(zhì)體包裹c(diǎn)lodronate可被巨噬細(xì)胞吞噬、消化，進(jìn)而clodronate釋放、聚集于細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)clodronate達(dá)到一定濃度后，可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞凋亡[8-9]。本研究中，輸注脂質(zhì)體包裹c(diǎn)lodronate早期，SD大鼠肝臟、脾臟紅髓及紅白髓移行處巨噬細(xì)胞消失，說明脂質(zhì)體包裹c(diǎn)lodronate能清除大鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞。而白髓內(nèi)有仍有少量CD68陽性巨噬細(xì)胞，這與Van Rooijen等實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，同時他們發(fā)現(xiàn)輸注脂質(zhì)體包裹c(diǎn)lodronate也不能清除胸腺、骨髓及淋巴結(jié)內(nèi)的巨噬細(xì)胞，并且在胸腺內(nèi)樹突狀細(xì)胞數(shù)無變化?？紤]原因可能是脂質(zhì)體大小與通入脾白髓、胸腺等組織的微循環(huán)血管內(nèi)皮組織間隙相似，從而使脂質(zhì)體不能進(jìn)入這些組織內(nèi)[8，10]。停止輸注脂質(zhì)體包裹c(diǎn)lodronate后，大鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞會逐漸恢復(fù)。由此可見，利用脂質(zhì)體包裹c(diǎn)lodronate的方法清除巨噬細(xì)胞的動物模型是可行的。而其對胸腺內(nèi)巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞不予清除，對本實(shí)驗(yàn)用此模型研究以中樞性克隆清除為主要作用機(jī)制的異種嵌合體尤為重要。

在非協(xié)調(diào)性異種移植供受體間，利用相同的方法卻不能獲得免疫耐受，其中原因之一就是供者骨髓細(xì)胞在受體體內(nèi)迅速消失而不能形成持續(xù)穩(wěn)定的嵌合體。有學(xué)者認(rèn)為在非協(xié)調(diào)性異種移植中，由于供者來源的骨髓細(xì)胞缺乏供者M(jìn)HC-I類分子，不能被供者NK細(xì)胞抑制性受體（KIR）識別，因而激活供者NK細(xì)胞而被殺傷清除，因此NK細(xì)胞在供體骨髓細(xì)胞迅速消失中起主要作用。然而Sykes M等[11]利用豬—SCID小鼠的模型研究表明，NK細(xì)胞對豬造血細(xì)胞在SCID小鼠體內(nèi)迅速消失并不起主要作用。

我們的實(shí)驗(yàn)中，利用非清髓的方法建立豚鼠到大鼠的非協(xié)調(diào)性異種混合嵌合體模型。我們發(fā)現(xiàn)在豚鼠骨髓細(xì)胞移植后，豚鼠骨髓細(xì)胞在受體大鼠外周血內(nèi)迅速減少。而在移植前利用脂質(zhì)體包裹c(diǎn)lodronate的方法清除受體大鼠巨噬細(xì)胞組，無論是移植后24h內(nèi)受體外周血、骨髓及脾臟中豚鼠源性細(xì)胞比例，還是預(yù)處理后21d及35d測外周血嵌合率，都明顯高于對照兩組。這些都說明大鼠的巨噬細(xì)胞在豚鼠BMC移植后迅速減少中起重要作用，在BMC移植前去除巨噬細(xì)胞可提高嵌合率。

由于豚鼠BMC細(xì)胞移植前去除巨噬細(xì)胞，豚鼠細(xì)胞早期在外周血中被巨噬細(xì)胞清除減少，因此24h內(nèi)測的豚鼠細(xì)胞比例均較其他兩組增高。隨著外周血中豚鼠細(xì)胞增多，植入大鼠骨髓中的豚鼠BMC細(xì)胞相應(yīng)增多，使豚鼠源性各造血系細(xì)胞生成增多，它們在胸腺內(nèi)植入后產(chǎn)生介導(dǎo)克隆丟失的樹突狀細(xì)胞和胸腺細(xì)胞，最終使來之豚鼠并遷移到外周的成熟胸腺細(xì)胞增多。因此，在我們的實(shí)驗(yàn)中，預(yù)處理后21d和35d發(fā)現(xiàn)去除巨噬細(xì)胞組測嵌合率明顯高于細(xì)胞移植前未去除巨噬細(xì)胞組。而此時從免疫組化結(jié)果來看，清除巨噬細(xì)胞組的大鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞已恢復(fù)到正常水平。因此在豚鼠BMC移植后早期（大鼠巨噬細(xì)胞恢復(fù)正常水平前）種植入大鼠骨髓中增多對提高嵌合水平有重要的作用。造血干細(xì)胞移植建立嵌合體常需要超大劑量干細(xì)胞，限制了其在臨床的運(yùn)用，而我們的實(shí)驗(yàn)似乎可以提供一些新的思路。

T細(xì)胞亞群的檢測對于判斷機(jī)體免疫耐受情況有重要意義[12]，在本實(shí)驗(yàn)中，我們選用了CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群的檢測。CD4+T細(xì)胞參與T細(xì)胞依賴性異種抗體的合成，可介導(dǎo)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒和ADCC作用，CD8+T細(xì)胞作為非依賴性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，在DXR中可直接殺傷移植物。如CD4+和CD8+T細(xì)胞均升高、且CD4/ CD8比值上升，這預(yù)示著排斥反應(yīng)即將發(fā)生。在我們的實(shí)驗(yàn)中，預(yù)處理21d后對照組及各BMC輸注組CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞較正常大鼠均降低，而在CD4+、CD8+T細(xì)胞中，CD4+T細(xì)胞降幅更大，故CD4/CD8比值下降。但在BMC組與對照組的相比中，CD4/ CD8比值下降的幅度無顯著差異。因此我們認(rèn)為，混合嵌合體對T細(xì)胞亞群的生成與分布并無影響，CD4/ CD8比值下降可能與CD4+T細(xì)胞比CD8+T細(xì)胞對γ射線照射更為敏感有關(guān)。

MLR是評價T細(xì)胞免疫應(yīng)答功能的經(jīng)典體外實(shí)驗(yàn)方法，可間接反映體內(nèi)T細(xì)胞對某一組織相容性抗原的免疫應(yīng)答功能，對客觀地判斷T細(xì)胞免疫應(yīng)答功能、免疫耐受的誘導(dǎo)及移植物的排斥均有重要的參考價值[13-14]。本實(shí)驗(yàn)通過對單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果的觀察，發(fā)現(xiàn)BMC移植三組刺激效應(yīng)都低于對照兩組，提示異種間建立混合嵌合體雖然對T細(xì)胞亞群的分布無影響，但其識別異種抗原的能力有所下降。而BMC移植前去除巨噬細(xì)胞組21d嵌合率較其他兩組高，刺激效應(yīng)較其他兩組BMC移植組低，且有顯著差異，說明提高嵌合水平可獲得更高程度的免疫抑制。

綜上所述，通過在BMC移植前清除受體巨噬細(xì)胞，增加了供體BMC在受體體內(nèi)的存活，從而提高嵌合水平，獲得了更高水平的免疫抑制，這為研究混合嵌合體在非協(xié)調(diào)性異種器官移植中免疫耐受機(jī)制提供必要的理論依據(jù)。

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