pH 值對纖維素酶在麥草堿木質(zhì)素上吸附的影響*

樓宏銘 李秀麗 王夢霞 邱學(xué)青? 楊東杰 鄧永紅

(1.華南理工大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，廣東 廣州 510640;2.華南理工大學(xué) 制漿造紙工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640)

隨著資源和環(huán)境問題的日益嚴(yán)重，越來越多的人將注意力集中在清潔能源的開發(fā)上.地球上每年植物光合作用的生物量可達(dá)2000 億噸，其中大部分為木質(zhì)纖維素類.由于其可再生性和廣泛性，木質(zhì)纖維素受到越來越多學(xué)者的關(guān)注［1］.木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三大部分組成，其中含量占到65%～75%的纖維素和半纖維素可以酶解而生成可發(fā)酵糖，進(jìn)而發(fā)酵得到乙醇［2］.

木質(zhì)纖維素的酶解是一個非常復(fù)雜的過程，受到很多因素的影響.首先，木質(zhì)纖維素的頑抗性是影響其高效酶解的重要因素之一，因此目前很多研究都是將木質(zhì)纖維素進(jìn)行物理或化學(xué)預(yù)處理，期望將木質(zhì)纖維素的三大組成部分分離開或是盡量降低木質(zhì)素的含量［3］，從而促進(jìn)纖維素酶在纖維素上的吸附，提高酶解效率，并減少酶的用量，降低生產(chǎn)成本［4］.其次，木質(zhì)素對木質(zhì)纖維素的酶解過程有一定的阻礙作用，主要體現(xiàn)在兩個方面:空間位阻效應(yīng)以及對纖維素酶的無效吸附［5］.由于通過預(yù)處理去除木質(zhì)素來消除木質(zhì)素對纖維素酶解過程帶來的空間位阻效應(yīng)的經(jīng)濟(jì)成本很高［3］，且木質(zhì)素的完全去除是不太可能的.纖維素酶在木質(zhì)素上的無效吸附不可避免，因此可行的辦法是減少纖維素酶在木質(zhì)素上的吸附.

減少纖維素酶在木質(zhì)素上的吸附的方法有很多種，如添加表面活性劑、蛋白質(zhì)和聚合物等.但是由于這些化學(xué)試劑成本較高，在大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中受到一定的限制.也有很多的學(xué)者將注意力集中于提高纖維素酶的回收利用，以降低木質(zhì)纖維素的酶解成本.有學(xué)者通過在酶解液中加入Span 80、Tween 80 和Tween 20 等來提高纖維素酶的回收率或加入新鮮的木質(zhì)纖維素來吸附并回收纖維素酶［9-10］.同時(shí)，超濾法也被用于纖維素酶的回收利用［11］，該方法幾乎可以回收全部游離的纖維素酶.但是以上方法都需要投入較高的成本.

石英晶體微天平(QCM-D)已被用于研究纖維素酶、蛋白質(zhì)等在木質(zhì)纖維素薄膜和纖維素薄膜上的吸附［6-9］.文中通過QCM-D 研究不同pH 值下纖維素酶在木質(zhì)素薄膜上的吸附和脫附情況.

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 主要試劑

醋酸鈉緩沖液的離子強(qiáng)度為50 mmol/L，pH 值分別為4.8、5.5、6.0;麥草堿木質(zhì)素經(jīng)過堿溶(pH=12)后超濾，再酸析(pH=2)水洗得到相對分子質(zhì)量大于30000 的產(chǎn)品;實(shí)驗(yàn)所用纖維素酶(CTec2)是木霉屬工業(yè)用纖維素酶，由諾維信公司提供，根據(jù)文獻(xiàn)［12］中的方法測得的酶活為147FPU/g glucan，蛋白質(zhì)含量為73.6 g/L.實(shí)驗(yàn)中所用的CTec2 溶液的酶蛋白含量為100 mg/L.

1.2 麥草堿木質(zhì)素薄膜的制備

采用旋涂法制備麥草堿木質(zhì)素薄膜.旋涂儀型號為WS-400Bz-6NPP-LITE (邁可諾公司，中國).首先用0.75 mol/L 的氨水溶液溶解麥草堿木質(zhì)素［13］，并攪拌24 h，10 000 r/min 離心5 min，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的麥草堿木質(zhì)素溶液.旋涂儀設(shè)置的轉(zhuǎn)速為2000 r/min，旋涂時(shí)間為60 s.

1.3 Zeta 電位測定

將pH=4.8、5.5、6.0 的CTec2 溶液分別注入電泳池中，測定Zeta 電位，殘差保持在0.05 以下，測定4 次取均值.

1.4 QCM-D 分析

實(shí)驗(yàn)采用金片，使用前用氨水(25%)、過氧化氫(30%)和純水質(zhì)量比為1∶1∶5 的混合液在75 ℃下處理5 min.QCM-D(Q-Sense 501 型，瑞典)為單通道流通池，蠕動泵流率控制在0.100 mL/min.

晶體石英微天平可以感測到十分微小的質(zhì)量變化，它測得的質(zhì)量和頻率的變化成反比，耗散因子(D)與薄膜的剛?cè)嵝猿烧?，也就是說，耗散因子越大，薄膜的柔性就越大，吸附薄膜就越疏松.由于第三倍頻的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)所采用的數(shù)據(jù)均為第三倍頻的數(shù)據(jù).

實(shí)驗(yàn)過程中，先用不同pH 值的醋酸鈉緩沖液進(jìn)行吸附試驗(yàn)(基線)，而且必須在吸附平衡后才能進(jìn)樣.等待吸附平穩(wěn)后，用纖維素酶溶液進(jìn)行吸附測試.纖維素酶的吸附實(shí)驗(yàn)采用靜態(tài)吸附模式，也就是當(dāng)QCM-D 的流通池內(nèi)充滿CTec2 溶液后停止蠕動泵.而脫附實(shí)驗(yàn)采用的是動態(tài)模式，也就是實(shí)驗(yàn)過程中一直保持蠕動泵的運(yùn)轉(zhuǎn)狀態(tài).

1.5 原子力顯微鏡(AFM)分析

測試儀器為韓國PARK 公司生產(chǎn)的XE-100 型原子力顯微鏡.選用NCHR 探針，設(shè)置掃描分辨率為512 ×512 像素，掃描頻率為1Hz，設(shè)置掃描模式為非接觸模式，掃描得麥草堿木質(zhì)素薄膜的表面形貌.測試的溫度設(shè)置為25 ℃.

2 結(jié)果與討論

2.1 麥草堿木質(zhì)素薄膜的穩(wěn)定性

CTec2 在麥草堿木質(zhì)素薄膜上的吸附實(shí)驗(yàn)必須在緩沖液吸附(基線)達(dá)到平衡以后才能進(jìn)行，所以，必須保證制得的麥草堿木質(zhì)素薄膜的穩(wěn)定性.圖1(a)所示是醋酸鈉緩沖液吸附的階段，從圖中可以看出，吸附量(-ΔF3)和耗散因子(ΔD3)在300 s 以后幾乎沒有發(fā)生變化，說明麥草堿木質(zhì)素薄膜沒有發(fā)生脫附現(xiàn)象，并且圖中顯示兩次實(shí)驗(yàn)具良好的重復(fù)性，再次說明所制得的麥草堿木質(zhì)素薄膜穩(wěn)定.而緩沖液吸附的過程(如圖1(b)所示)可以分為3 個階段:(1)ΔF3和ΔD3接近于零，在這個階段，引起ΔF3和ΔD3變化的是管路中的空氣在木質(zhì)素薄膜上的吸附;(2)緩沖液進(jìn)入流通池，與麥草堿木質(zhì)素發(fā)生接觸，使麥草堿木質(zhì)素薄膜發(fā)生快速溶脹，所以ΔF3和ΔD3的變化都很大;(3)醋酸鈉緩沖液充滿整個流通池，麥草堿木質(zhì)素薄膜充分溶脹，以至于ΔF3和ΔD3的變化很小，說明此時(shí)木質(zhì)素薄膜已達(dá)到穩(wěn)定的溶脹狀態(tài).

原子力顯微鏡掃描圖(圖1(c))顯示，在用緩沖液吸附前后，麥草堿木質(zhì)素薄膜的表面粗糙度分別為0.894 和0.842 nm.從麥草堿木質(zhì)素的表面形貌以及粗糙度的變化來看，麥草堿木質(zhì)素薄膜在實(shí)驗(yàn)過程中表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性，從而保證了實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行.

2.2 纖維素酶在麥草堿木質(zhì)素上的吸附形態(tài)

為了研究CTec2 在麥草堿木質(zhì)素薄膜上的吸附形態(tài)，在緩沖液的吸附達(dá)到平衡后，測定CTec2 在麥草堿木質(zhì)素薄膜上吸附和脫附時(shí)ΔF3和ΔD3的變化，如圖2 所示.其中，CTec2 溶液用pH =5.5、離子強(qiáng)度為50 mmol/L 的醋酸鈉緩沖液配制.從圖中可以看出，CTec2 在麥草堿木質(zhì)素上的吸附階段，耗散因子(ΔD3)隨CTec2 的吸附量(-ΔF3)的增大而增大，說明麥草堿木質(zhì)素薄膜在吸附上CTec2 后，膜的柔性或者厚度明顯增大，當(dāng)CTec2 的吸附達(dá)到平衡后，ΔF3和ΔD3不再發(fā)生變化.從CTec2 在麥草堿木質(zhì)素薄膜上的脫附過程來看，ΔD3隨ΔF3的變化更加明顯，但是在脫附完成時(shí)，ΔF3并沒有達(dá)到CTec2的脫附初始值，說明CTec2 并沒有完全脫附，也就是說吸附在麥草堿木質(zhì)素薄膜上的CTec2 有可逆吸附和不可逆吸附之分.所以，從纖維素回收的角度來看，增大纖維素酶在木質(zhì)素上的可逆吸附有利于提高纖維素酶的回收率，降低木質(zhì)纖維素的酶解成本.

圖1 醋酸鈉緩沖液(pH =4.8，離子強(qiáng)度為50 mmol/L)吸附平衡后，麥草堿木質(zhì)素薄膜的變化Fig.1 Film change of wheat straw alkaline lignin after the adsorption equilibrium in sodium acetate solution with a pH value of 4.8 and an ionic strength of 50 mmol/L

圖2 CTec2 在麥草堿木質(zhì)素薄膜上的吸附引起的ΔF3和ΔD3的變化Fig.2 Change of ΔF3and ΔD3 induced by the adsorption of CTec2 on wheat straw alkaline lignin film

2.3 pH 值對纖維素酶在麥草堿木質(zhì)素薄膜上吸附的影響

用Zeta 電位測得CTec2 的等電點(diǎn)pI 值為4.37，所以在pH =4.8，5.5，6.0 時(shí)，CTec2 會帶負(fù)電，且pH 值越高，CTec2 所帶的負(fù)電荷越多.而木質(zhì)素在所討論的pH 值下也是帶負(fù)電的.實(shí)驗(yàn)測得pH =4.8，5.5，6.0 時(shí)，CTec2 的蛋白含量為100 mg/L 時(shí)的Zeta 電位分別為(-5.85 ±0.23)、(-8.26 ±0.34)、(-10.47 ±0.30)mV.所以，在pH =4.8 時(shí)CTec2 與木質(zhì)素之間存在靜電斥力，在pH =5.5 以及更高的pH 值時(shí)CTec2 與木質(zhì)素之間存在的靜電斥力更大.因此，在較低的pH 值下，CTec2 在麥草堿木質(zhì)素上的吸附量較大，如圖3(a)所示.

如圖3(b)所示，不同的pH 值下，CTec2 在木質(zhì)素上吸附的ΔF3、ΔD3關(guān)系圖的斜率有很大的不同，pH 值越高斜率越大.ΔD3-ΔF3曲線的斜率通常用來表征吸附膜的粘彈性，這與吸附的分子的結(jié)構(gòu)以及構(gòu)象有密切的聯(lián)系.pH 值越高，CTec2 與木質(zhì)素之間的靜電斥力越大，也就使得CTec2 在麥草堿木質(zhì)素表面形成的吸附膜越疏松，從而表現(xiàn)出更大的粘彈性.圖3(b)結(jié)果表明，當(dāng)纖維素酶的量一定時(shí)，減少纖維素酶在木質(zhì)素上的吸附可以增大其在纖維素上的吸附量，從而提高木質(zhì)素纖維素的酶解效率.Lou 等［14-15］的研究發(fā)現(xiàn)，在較高的pH 值下，木質(zhì)纖維素的酶解效率明顯提高，原因可能是因?yàn)檩^高的pH 值下纖維素酶在木質(zhì)素上的吸附減少，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果恰好證實(shí)了這一點(diǎn).

圖3 pH 值為4.8、5.5 和6.0 時(shí)CTec2 在麥草堿木質(zhì)素薄膜上的吸附Fig.3 Adsorption of CTec2 on wheat straw alkaline lignin film at the pH values of 4.8、5.5 and 6.0

2.4 pH 值對纖維素酶在麥草堿木質(zhì)素薄膜上脫附的影響

離子強(qiáng)度為50 mmol/L 時(shí)，pH 值對CTec2 在麥草堿木質(zhì)素薄膜上的脫附的影響如表1 所示.從表1 中可以看出，在相同的pH 值下吸附后再用不同pH 值的醋酸鈉緩沖液進(jìn)行脫附，脫附pH 值越高，CTec2 的脫附量越大，CTec2 的可逆吸附部分占全部吸附量的比例也越大.因?yàn)樵谳^高的pH 值下，CTec2 與麥草堿木質(zhì)素之間的靜電斥力較大，而且CTec2 在麥草堿木質(zhì)素上形成的吸附膜更為疏松，粘彈性更大，所以使得CTec2 更容易從麥草堿木質(zhì)素薄膜上脫附下來.因此，可利用纖維素酶在較高的pH 值下較易脫附的特點(diǎn)來回收纖維素酶，增大纖維素酶的利用率，并降低成本.

表1 離子強(qiáng)度為50 mmol/L 時(shí)，pH 值對CTec2 在麥草堿木質(zhì)素薄膜上脫附的影響Table 1 Effect of pH value on the desorption of CTec2 on wheat straw alkaline lignin when the ionic strength of buffer is 50 mmol/L

3 結(jié)論

用旋涂法制得的麥草堿木質(zhì)素薄膜平滑而且穩(wěn)定性很好，可用于研究CTec2 在麥草堿木質(zhì)素薄膜上的吸附和脫附情況.纖維素酶在麥草堿木質(zhì)素上的吸附存在可逆吸附和不可逆吸附之分.在較高的pH 值下，纖維素酶與麥草堿木質(zhì)素之間的靜電斥力較大，形成的吸附膜較為疏松，纖維素酶在麥草堿木質(zhì)素薄膜上的吸附量較少，有利于提高木質(zhì)纖維素的酶解效率.同時(shí)，較高的pH 值下，纖維素酶在麥草堿木質(zhì)素薄膜上的吸附變得不牢固，可逆吸附部分的纖維素酶增多，從而會有更多的纖維素酶從麥草木質(zhì)素薄膜上脫附下來，提高纖維素的回收利用率.

［1］Yang B，Wyman C E.Pretreatment:the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol［J］.Biofuels Bioprod Biorefin Biofpr，2008，2(1):26-40.

［2］Himmel M，Ding S，Johnson D，et al.Biomass recalcitrance:engineering plants and enzymes for biofuels production［J］.Science，2007，315(5813):804-807.

［3］Chandra R P，Bura R，Mabee W E，et al.Substrate pretreatment:the key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics［J］.Adv Biochem Eng Biotechnol，2007，108(6):67-93.

［4］Selig M J，Knoshaug E P，Adney W S，et al.Synergistic enhancement of cellobiohydrolase performance on pretreatedcorn stover by addition of xylanase and esterase activities ［J］.Bioresour Technol，2008，99(11):4997-5005.

［5］Leu S Y，Zhu J Y.Substrate-related factors affecting enzymatic saccharification of lignocelluloses:our recent understanding［J］.Bioenerg Res，2013，6(2):405-415.

［6］Hoeger I C，F(xiàn)ilpponen I，Sampedro R M，et al.Bicomponent lignocellulose thin films to study the role of surface lignin in cellulolytic reactions ［J］.Biomacromolecules，2012，13(10):3228-3240.

［7］Sampedro R M，Rahikainen J L，Johansson L S，et al.Preferential adsorption and activity of monocomponent cellulase on lignocellulose thin films with varying lignin content［J］.Biomacromolecules，2013，14(4):1231-1239.

［8］Salas C，Rojas O J，Lucia L A，et al.On the surface interactions of proteins with lignin［J］.ACS Appl Mater Inter，2013，5(1):199-206.

［9］Tu M，Chandra R P，Saddler J N.Recycling cellulases during the hydrolysis of steam exploded and ethanol pretreated lodgepole pine ［J］.Biotechnol Prog，2007，23(5):1130-1137.

［10］Yang B，Wyman C E.BSA treatment to enhance enzymatic hydrolysis of cellulose in lignin containing substrates［J］.Biotechnol Bioeng，2006，94(4):611-617.

［11］Qi B，Luo J Q，Chen X R，et al.Application of ultrafiltration and nanofiltration for recycling cellulase and concentrating glucose from enzymatic hydrolyzate of steam exploded wheat straw ［J］.Bioresour Technol，2012，104:466-472.

［12］Wood T M，Bhat K M.Methods for measuring cellulase activities［J］.Method Enzymol，1988，160:87-112.

［13］Norgren M，Notley S M，Majtnerova A，et al.Smooth model surfaces from lignin derivatives.I.preparation and characterization ［J］.Langmuir，2006，22 (3):1209-1214.

［14］Lou H M，Zhu J Y，Lan T Q，et al.pH-induced lignin surface modification can reduce nonspecific cellulase binding to enhance enzymatic saccharification of lignocelluloses［J］.ChemSusChem，2013，6(5):919-927.

［15］Lan T Q，Lou H M，Zhu J Y.Enzymatic saccharification of lignocellulase should be conducted at elevated pH 5.2-6.2［J］.Bioenerg Res，2013，6(5)，475-485.