兩種組成型啟動子P ermE*和P Sau3A在變鉛青鏈霉菌中的啟動效果比較

張 瑩,陶欣藝,王風(fēng)清,魏東芝

(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室魯華生物技術(shù)研究所,上海200237)

兩種組成型啟動子P ermE*和P Sau3A在變鉛青鏈霉菌中的啟動效果比較

張 瑩,陶欣藝,王風(fēng)清,魏東芝

(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室魯華生物技術(shù)研究所,上海200237)

紅霉素抗性啟動子P erm E*和來源于鏈霉菌核基因組片段的P Sau3A啟動子均屬于鏈霉菌組成型強啟動子,分別將它們插入大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒p NW-S1的SD序列和轉(zhuǎn)錄起始位點之間,構(gòu)建成兩個穩(wěn)定的組成型表達質(zhì)粒:p NW-S3和p NW-S4。以磷脂酰絲氨酸合成酶PSS基因為報道基因,以蛋白表達水平評價這兩個啟動子在變鉛青鏈霉菌TK24中的表達效果。結(jié)果表明,在兩株組成型表達重組菌中,PSS均得到了高效表達,具有在鏈霉菌系統(tǒng)中高效表達外源基因的功能,其中P erm E*的啟動效率略高于P Sau3A。

組成型啟動子;鏈霉菌;磷脂酰絲氨酸合成酶

鏈霉菌屬于放線菌的一科,是G+C含量較高的革蘭氏陽性菌,可生產(chǎn)多種抗生素,同時還能分泌大量的胞外蛋白,如各種水解酶和蛋白類的酶抑制劑等,廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中,特別是食品醫(yī)藥行業(yè)。鏈霉菌的高效分泌能力、人畜的非致病性以及成熟的發(fā)酵工藝使其成為表達異源蛋白的新宿主[1]。

作為一種具有巨大應(yīng)用價值的生產(chǎn)菌,鏈霉菌的代謝過程是一個復(fù)雜的、互相偶聯(lián)的多層次調(diào)控過程,而啟動子和其它順式調(diào)控序列構(gòu)成了這個調(diào)控系統(tǒng)中的基礎(chǔ)部分[2]。鏈霉菌工程菌的啟動子多為誘導(dǎo)型啟動子,其表達效果雖然優(yōu)于一般的組成型啟動子,但是需要IPTG、硫鏈絲菌素等誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo),增加了鏈霉菌作為安全生產(chǎn)宿主的局限性,對于表達一些有安全要求的目的基因時,增加了后期分離純化和醫(yī)藥審批的難度,限制了其工業(yè)化應(yīng)用。因此,構(gòu)建高效安全的組成型鏈霉菌表達載體,用以表達醫(yī)藥食品行業(yè)中有安全要求的基因,具有重要的實際意義。

目前,鏈霉菌常用的組成型啟動子是紅霉素抗性啟動子P erm E,尤其是改造過的P erm E*啟動子[3,4],而對其它組成型啟動子的研究較少。Horinouchi等[5]篩選到一個來源于鏈霉菌的約120 bp的基因片段[6],具有較高的啟動子活性,是紅霉素啟動子P erm C活性的2.4倍。作者選用常用的鏈霉菌異源基因表達宿主變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans) TK24作為轉(zhuǎn)化受體,P erm E*和P Sau3A作為啟動子,以磷脂酰絲氨酸合成酶(PSS)作為報告基因,分別構(gòu)建兩種不同的組成型表達載體,評價比較這兩種啟動子的啟動效率,以期構(gòu)建高效安全的鏈霉菌組成型表達質(zhì)粒,應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α購于天根生化科技公司。含有紅霉素抗性啟動子P ermE*的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒pIJ4090和表達菌株變鉛青鏈霉菌TK24為自行保存。大腸桿菌-鏈霉菌穿梭表達質(zhì)粒pNW-S1為前期構(gòu)建。

1.1.2 鏈霉菌啟動子

紅霉素抗性強啟動子Perm E*來源于pIJ4090質(zhì)粒。在尋找效果更好的組成型啟動子時,發(fā)現(xiàn)來源于Streptomyces griseus的具有強啟動子活性的基因片段,約1.6 kb,在保證后續(xù)研究中啟動子活性不降低的情況下,最終確定該片段長度為124 bp。將該段序列命名為P Sau3A,由捷瑞生物公司進行基因合成,以連接在p GH質(zhì)粒(p GH-P Sau3A)上的形式返回。

1.1.3 磷脂酰絲氨酸合成酶基因

鏈霉菌來源的磷脂酰絲氨酸合成酶PSS基因為前期克隆保存。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基用于大腸桿菌的培養(yǎng)和重組質(zhì)粒的提取。TBS培養(yǎng)基用于鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)。R2YE培養(yǎng)基用于鏈霉菌的固體斜面培養(yǎng)[7]。CP培養(yǎng)基用于鏈霉菌原生質(zhì)體的制備[8]。

1.1.5 工具酶、PCR酶以及引物

限制性內(nèi)切酶購于Takara公司。引物由捷瑞生物公司合成:P erm F(5′-GCAGGTCCAGCCCGACCCGAGC-3′)和P erm R(5′-GGTACCGTCGATCCTACCAACCGG-3′)用于擴增P erm E*啟動子。

1.2 鏈霉菌的轉(zhuǎn)化

操作方法參見文獻[8]。

1.3 p NW-S2質(zhì)粒的構(gòu)建

大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒p NW-S1中含lacZ啟動子,在pNW-S1 lacZ誘導(dǎo)型啟動子下游的轉(zhuǎn)錄起始位點和SD序列之間插入多克隆位點(Xba I、Spe I和Sca I),構(gòu)建pNW-S2質(zhì)粒,用于插入組成型啟動子。

1.4 組成型質(zhì)粒p NW-S3和p NW-S4的構(gòu)建

以pIJ4090質(zhì)粒為模板,通過PCR擴增后獲得啟動子P erm E*,與p NW-S2質(zhì)粒分別進行XbaⅠ和SpeⅠ酶切后再通過T4連接酶16℃連接,轉(zhuǎn)化入DH5α,重組質(zhì)粒命名為p NW-S3。

p GH-P Sau3A通過Xba I、Spe I雙酶切、膠回收后連接入p NW-S2質(zhì)粒中,轉(zhuǎn)化入DH5α后,重組質(zhì)粒命名為p NW-S4。

1.5 PSS重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建及PSS基因的亞克隆

根據(jù)p NW質(zhì)粒的多克隆位點,設(shè)計PSS的上下游引物(Bam H IF:5′-CG GGATCC TTGATCAAGGTCGGAGGCGTGG-3′;Hin dⅢR:5′-CCC AAGCTT TCAGCCCTGGCAGAGGCCGCGG-3′),通過酶切連接的方法將PSS序列分別插入p NW-S3和p NWS4表達載體的Bam H I和Hin dⅢ之間,構(gòu)建PSS重組表達質(zhì)粒將構(gòu)建的PSS重組表達質(zhì)粒以及空載體p NW-S1通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化進入變鉛青鏈霉菌TK24,鋪抗生素水膜2 d后,長出大量白色菌體,挑取抗性轉(zhuǎn)化子,分別提取其基因組,用PSS特異性引物擴增,得到目的基因1600 bp片斷的陽性轉(zhuǎn)化子。

1.6 磷脂酰絲氨酸合成酶的活性測定

酶活的測定采用酶聯(lián)法。在文獻[9]以及前期研究基礎(chǔ)上,確定反應(yīng)體系為:100μL 8 mmol·L-1底物+400μL底物緩沖溶液+10μL酶液(發(fā)酵上清液), 37℃反應(yīng)10 min,加200μL EDTA反應(yīng)終止液,煮沸5 min,加100μL 4-ATT溶液、10μL膽堿氧化酶, 5μL過氧化氫酶,37℃反應(yīng)3 h,505 nm測OD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 p NW-S2質(zhì)粒的構(gòu)建

以p NW-S1質(zhì)粒為模板,用相應(yīng)引物分別PCR擴增插入多克隆位點上游1871 bp的F片段(圖1a)和下游約400 bp的R片段(圖1b),進行DNA電泳后膠回收,與p NW-S1質(zhì)粒分別雙酶切(圖1c)后,進行三片段的連接后轉(zhuǎn)化入DH5α。培養(yǎng)14 h后,長出均勻的單個克隆,轉(zhuǎn)接入LB液體試管中,培養(yǎng)過夜后,送測序公司測序,結(jié)果顯示陽性克隆已經(jīng)成功插入3個單一的酶切位點ScaⅠ、SpeⅠ、XbaⅠ,p NW-S2構(gòu)建成功。

圖1 pNW-S2質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of plasmid pNW-S2

2.2 p NW-S3和p NW-S4質(zhì)粒的構(gòu)建

p IJ4090質(zhì)粒用通用引物PCR擴增出約2000 bp的特異性引物,送測序公司測序后,返回結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫的紅霉素抗性啟動子比對,該序列含有紅霉素抗性基因的P erm E*啟動子,通過設(shè)計的特異性引物P erm F和P erm R,PCR擴增得到P erm E*片段(圖2a),切膠回收。同時,以p GH-P Sau3A質(zhì)粒為模板, PCR擴增得到約130 bp的特異性條帶(圖2b),切膠回收。

圖2 P ermE*啟動子(a)、P Sau3A啟動子(b)的PCR擴增Fig.2 PCR Amplification of the promoters P ermE*(a)and P Sau3A(b)

擴增得到的P erm E*和P Sau3A啟動子片段與質(zhì)粒p NW-S2分別進行SpeⅠ、XbaⅠ雙酶切純化后,連接,轉(zhuǎn)化入DH5α后,挑取單個克隆進行PCR驗證。PCR擴增時由于引物長度過小,不易與引物二聚體分開,故使用啟動子上游引物和R片段下游引物進行PCR擴增。驗證結(jié)果見圖3,選取克隆1、4、8、12進行測序驗證。根據(jù)測序返回結(jié)果,克隆1和8分別正確插入P erm E*和P Sau 3A片段,命名為p NW-S3、p NW-S4。

圖3 p NW-S3和pNW-S4陽性克隆的PCR驗證Fig.3 PCR Verification of positive clones p NW-S3 and p NW-S4

2.3 p NW-S系列質(zhì)粒的構(gòu)建(圖4)

圖4 p NW-S系列質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.4 Construction of p NW-S plasmids

2.4 PSS基因的亞克隆

以p MD19T-PSS質(zhì)粒為模板PCR擴增得到大小約1800 bp的PSS片段,與p NW-S3、p NW-S4質(zhì)粒同時進行Bam H I、Hin dⅢ酶切,分別連接轉(zhuǎn)化,最終篩選得到了p NW-S3-PSS和p NW-S4-PSS重組質(zhì)粒。按1.5方法進行PSS基因的亞克隆,其PCR驗證結(jié)果見圖5。

圖5 重組菌株pNW-S3-PSS和pNW-S4-PSS的PSS基因的PCR驗證Fig.5 PCR Verification of PSSgene in pNW-S3-PSSand pNW-S4-PSS

2.5 啟動子的活性分析

2.5.1 PSS的酶活

將重組克隆接入TBS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后,取各克隆發(fā)酵上清液測定PSS的酶活和蛋白總量,共進行4次發(fā)酵平行實驗,結(jié)果取平均值,見表1。

表1 PSS酶活和蛋白總量Tab.1 PSS Activity and total protein

由表1可知,p NW-S3-PSS和p NW-S4-PSS的平均酶活分別達到40.2 U·m L-1和31.3 U·m L-1,是原始菌株P(guān)SS活性的31倍和23倍。P erm E*啟動的重組菌p NW-S3-PSS的PSS酶活和蛋白總量高于P Sau3A啟動的p NW-S4-PSS重組菌,說明P erm E*啟動子的啟動效果優(yōu)于P Sau3A啟動子。

2.5.2 PSS的蛋白表達

PSS在變鉛青鏈霉菌TK24中的表達見圖6A。

圖6 PSS在變鉛青鏈霉菌TK24中的表達Fig.6 The expression of PSSin Streptomyces lividans TK24

由圖6A可以看出,p NW-S3-PSS和pNW-S4-PSS重組克隆的發(fā)酵上清液中均有明顯的PSS目的條帶,分子量與原始PSS的條帶大小一致,約54 k Da,證明PSS在變鉛青鏈霉菌TK24中獲得成功表達。重組菌株p NW-S3-PSS發(fā)酵上清液中的PSS目的蛋白量明顯高于p NW-S4-PSS,這與PSS酶活測定的結(jié)果一致,再次說明P erm E*的啟動效果好于P Sau3A。同時在傳代20次后,提取TK24的基因組,用PSS特異性引物PCR擴增,均擴增出一條約1600 bp的特異性條帶(圖6B),驗證了PSS基因的存在,并且顯示了這兩個重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性。

2.6 討論

在所有紅霉素抗性啟動子中,P erm E*強啟動子效果最好,它是在P erm E基礎(chǔ)上將-35I區(qū)的TGG缺失,啟動子活性大幅提高;啟動子P Sau3A的-35區(qū)和-10區(qū)之間間隔18 bp,符合原核生物強啟動子的最佳間隔(17±1)bp。并且由于這兩個啟動子都來源于鏈霉菌,所以在同源的鏈霉菌表達系統(tǒng)中,能夠充分發(fā)揮啟動子的作用,高效地啟動表達外源基因,特別是同源基因。因此這兩個啟動子均能高效啟動報道基因PSS的表達,最終PSS在變鉛青鏈霉菌TK24中獲得穩(wěn)定表達,其表達活性比原始菌株的活性提高了20倍以上。同時,實驗發(fā)現(xiàn)P erm E*啟動PSS的效果要好于P Sau3A啟動子。這可能是由于P erm E*啟動子包含了2個-35區(qū)和-10區(qū),屬于多重啟動子,有2個RNA聚合酶結(jié)合位點,而P Sau3A啟動子片段較短,只含有1個-35區(qū)和-10區(qū),只有1個RNA聚合酶結(jié)合位點,轉(zhuǎn)錄目的基因的效率略低于多重啟動子。

通過對實驗室已構(gòu)建的誘導(dǎo)型鏈霉菌表達質(zhì)粒p NW-S1進行改造,分別插入2個高效的組成型啟動子P erm E*和P Sau3A,構(gòu)建2個組成型鏈霉菌表達質(zhì)粒p NW-S3和p NW-S4。PSS酶活和SDS蛋白電泳條帶分析均表明PSS蛋白在變鉛青鏈霉菌TK24中獲得高效的表達。證明P ermE*和P Sau3A啟動子在不需要誘導(dǎo)劑的條件下,成功啟動了PSS基因的表達,鏈霉菌組成型表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。同時,由于組成型啟動子與誘導(dǎo)型啟動子lacZ的并存(組成型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子聯(lián)用的啟動效果正在進一步研究中),使得該組質(zhì)?？梢栽诮M成型表達和組成型-誘導(dǎo)型表達之間靈活選擇,從而滿足復(fù)雜多樣的外源基因表達和工業(yè)生產(chǎn)要求,具有廣闊的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

紅霉素抗性啟動子P erm E*和來源于鏈霉菌核基因組片段的P Sau3A啟動子均屬于鏈霉菌組成型強啟動子,分別將它們插入大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒p NW-S1的SD序列和轉(zhuǎn)錄起始位點之間,構(gòu)建成兩個穩(wěn)定的組成型表達質(zhì)粒:p NW-S3和p NW-S4。以磷脂酰絲氨酸合成酶基因PSS為報道基因,以蛋白表達水平評價這兩個啟動子在變鉛青鏈霉菌TK24中的表達效果。結(jié)果表明,在兩株組成型表達重組菌中,PSS均得到了高效表達,具有在鏈霉菌系統(tǒng)中高效表達外源基因的功能,其中P erm E*的啟動效率略高于P Sau3A。

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Promotion Efficiency Comparison of Constitutive Promoters P ermE*and P Sau3A in Streptomyces Lividans

ZHANG Ying,TAO Xin-yi,WANG Feng-qing,WEI Dong-zhi
(National Engineering Research Center for Biotechnology,Newworld Institute of Biotechnology, East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

Erythromycin resistance promoter P erm E*and promoter fragment P Sau3A from Streptomyces nuclear genome are constitutive promoters stronger than general promoter.They were inserted between the SD sequence and transcription start site of the E.coli-Streptomyces shuttle plasmid p NW-S1 to construct two stable constitutive expression plasmids:p NW-S3 and p NW-S4.Phosphatidylserine synthase(PSS)gene,as a reporter gene,was cloned into plasmid p NW-S3 and p NW-S4 to be transformed into Streptomyces lividans TK24.The promoter activity was evaluated by SDS electrophoresis and PSS activity assay.It showed that PSS was over-expressed with 20 times activity compared to wild strain in TK24,which proved the p NW-S3 and p NW-S4 expression vectors could highly express foreign genes.Promotion effeciency of P erm E*was superior to that of P Sau3A.

constitutive promoter;Streptomyces;phosphatidylserine synthase

Q 785

A

1672-5425(2013)11-0047-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.11.011

2013-09-10

張瑩(1987-),女,陜西漢中人,碩士研究生,研究方向:生物化學(xué)與分子生物學(xué);通訊作者:魏東芝,教授,E-mail:dzhwei @ecust.edu.cn。