高溫脅迫下匍匐翦股穎耐熱突變體“粵選1號(hào)”能量水平研究

涂慶華，莫億偉，陳 平

(1．江西撫州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西撫州344000;2．紹興文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江紹興312000;3．仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院園林園藝學(xué)院，廣東廣州510225)

冷季型草坪草的光合作用對(duì)高溫脅迫非常敏感，維持較高的光合效率通常是草坪草抵抗熱害的首要生存策略［1］，葉片光合色素吸收光能通過(guò)光反應(yīng)后轉(zhuǎn)化為光合力(ATP和NADPH)，葉綠體內(nèi)ATP主要通過(guò)光合磷酸化產(chǎn)生，由類(lèi)囊體膜上ATPase催化，因此ATPase活性對(duì)葉綠體內(nèi)ATP合成起著決定作用;當(dāng)葉綠體內(nèi)ATP供應(yīng)不足，直接導(dǎo)致RuBP合成受阻，使RuBPcase底物供應(yīng)不足，從而降低葉片的光合效率［2-3］．ZHENG 等［4］指出，當(dāng)小麥旗葉片受水分和鹽脅迫時(shí)，葉綠體ATPase酶活性下降，葉片ATP含量顯著減少，旗葉的光合速率降低，說(shuō)明ATP供應(yīng)能量與植物光合效率有密切關(guān)系［5］．

匍匐翦股穎(Agrostis stolonifera)是優(yōu)良冷季型草坪草，被廣泛應(yīng)用于高爾夫球場(chǎng)果嶺、球道和足球場(chǎng)等，但因耐熱性差很難在華南地區(qū)安全越夏．陳平等［6-8］從匍匐翦股穎“Penncross”的營(yíng)養(yǎng)體自然突變中篩選到耐熱突變體“粵選1號(hào)”，其色澤、觸感、繁殖能力等性狀均優(yōu)于親本，經(jīng)過(guò)多年的應(yīng)用，在華南地區(qū)可終年常綠．“粵選1號(hào)”具有優(yōu)良的耐熱特性，耐熱突變體的耐熱機(jī)制與光合速率和葉片的ATP供應(yīng)的關(guān)系不清楚．TEZARA等［2］認(rèn)為:ATP供應(yīng)不足導(dǎo)致了光合作用底物RuBP合成能力下降，使RuBPcase所需底物供應(yīng)減少;還有一種可能是ATP供應(yīng)不足導(dǎo)致RuBPcase活化量減少［9］．

本文以匍匐翦股穎耐熱突變體“粵選1號(hào)”及親本“Penncross”為研究材料，從葉片光合效率和能量代謝的關(guān)系進(jìn)行分析，探討高溫脅迫下能量供應(yīng)水平對(duì)光合作用的影響，為“粵選1號(hào)”大面積地推廣提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

“粵選1號(hào)”是從Penncross營(yíng)養(yǎng)體自然突變篩選出來(lái)的耐熱優(yōu)良新品種(2004年12月通過(guò)國(guó)家品種審定，品種登記號(hào)288)．本研究的材料“粵選1號(hào)”及親本Penncross均由陳平提供．

1．1 材料的培養(yǎng)和高溫處理

栽培基質(zhì)為泥炭土、菜園土、河沙，按質(zhì)量比1∶1∶1混勻后裝盆，取生長(zhǎng)一致、健壯的“粵選1號(hào)”及親本“Penncross”的長(zhǎng)度為2～3 cm營(yíng)養(yǎng)枝進(jìn)行扦插，成活后自然光照，每周用1/2濃度的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌1次，以保證每盆有充足的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)．植株生長(zhǎng)達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求時(shí)，轉(zhuǎn)到人工氣候箱內(nèi)，光照條件為14 h/10 h(晝/夜)，光強(qiáng)為500 ～800 μmol/(m2·S)，相對(duì)濕度為80% ～85%，溫度為25℃/20℃(晝/夜)，經(jīng)過(guò)3～5 d適應(yīng)后，用35℃/30℃(晝/夜)高溫處理，保持原來(lái)的濕度和光照周期．在處理0、12、24、36、48 h 后，隨機(jī)選取生長(zhǎng)一致第二片成熟葉片進(jìn)行生理測(cè)定分析．

1．2 光合速率和光合放氧速率的測(cè)定

按照陳平等［6］的方法，用Li-6400法測(cè)定葉片光合速率;葉片光合放氧速率的測(cè)定參照莫億偉等［10］用液相氧電極方法測(cè)定．在飽和光照和CO2濃度下，測(cè)定不同溫度條件下葉片光合放氧速率．

1．3 葉綠體的分離與純化及葉綠體ATPase活性的測(cè)定

葉綠體的提取參照芮琪等［11］的方法．差速離心，通過(guò)1 mol/L葡萄糖溶液離心后，得到初步純化的葉綠體，用最適宜的Percoll濃度進(jìn)行梯度離心，分離到完整率更高的葉綠體．用氧電極測(cè)定葉綠體的Hill反應(yīng)結(jié)合熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，保障完整率大于80%［11］．參照Z(yǔ)HENG 等［4］的方法測(cè)定葉綠體Mg2+-ATPase和Ca2+-ATPase活性．

1．4 葉片和葉綠體ATP、ADP和AMP含量的測(cè)定與能荷分析

參照YOICHI［12］的方法進(jìn)行分析．取1 g鮮葉片加入6mL的預(yù)冷HClO4溶液(0．5mol/L)研磨混勻，在4℃下，低溫離心(10 000 g/min)15 min;上清液用 0．5 mol/L 的 KOH 溶液調(diào)節(jié) pH 至 6．8 ～7．0．再定容搖勻，0．45μm濾頭過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)．色譜柱為:Sepax Bio-C18(250 mm ×4．6 mm ID．5 m);流動(dòng)相為150 mmol/L NaH2PO4和K2HPO4組成的緩沖液(pH 6．68)，流速是 1．0 mL/min，柱溫是 30 ℃;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為259 nm，每次進(jìn)樣量為10μL．測(cè)定結(jié)果以每克鮮葉所含ATP、ADP、AMP的毫克計(jì)．

1．5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS 13．0軟件對(duì)組間進(jìn)行單因素差異性分析．

2 結(jié)果與分析

2．1 高溫脅迫對(duì)“粵選1號(hào)”和親本光合速率的影響

正常生長(zhǎng)條件下，“粵選1號(hào)”和親本葉片凈光合速率之間無(wú)顯著差異．高溫脅迫處理后，親本葉片的光合速率急劇下降，脅迫48 h時(shí)，比協(xié)迫處理前下降了42．17%，而“粵選1號(hào)”的光合速率只下降了33．07%(圖1)，兩者間的差異達(dá)顯著水平(P≤0．05)．說(shuō)明高溫脅迫下，“粵選1號(hào)”葉片光合速率對(duì)高溫脅迫有更強(qiáng)的耐性．

圖1 高溫脅迫對(duì)“粵選1號(hào)”和親本葉片光合速率的影響Figure 1 Effect of high temperature stress on photosynthetic rate of“Yuexuan 1”and its parent leaves

2．2 高溫脅迫對(duì)“粵選1號(hào)”和親本葉片光合放氧速率的影響

高溫脅迫前，“粵選1號(hào)”和親本葉片光合放氧速率之間沒(méi)有顯著差異．高溫脅迫后，親本葉片的光合放氧速率急劇下降．當(dāng)脅迫48 h時(shí)，比處理前下降了31．11%，而“粵選1號(hào)”葉片的光合速率只下降了21．21%(圖2)，兩者間差異達(dá)顯著(P≤0．05)．說(shuō)明高溫脅迫下，“粵選1號(hào)”葉綠體PSII的光合放氧中心在高溫脅迫下比親本有更強(qiáng)的耐性，光合放氧速率受到影響較?。?/p>

圖2 高溫脅迫對(duì)“粵選1號(hào)”和親本葉片光合放氧速率的影響Figure 2 Effects of high temperature stress on photosynthetic oxygen evolution rate of“Yuexuan 1”and its parent leaves

2．3 高溫脅迫對(duì)“粵選1號(hào)”和親本葉片 ATP、ADP、AMP及能荷變化影響

能量組分主要是由ATP、ADP和AMP組成．在高溫脅迫處理前，“粵選1號(hào)”和親本葉片ATP、ADP和AMP的含量沒(méi)有顯著差異．經(jīng)高溫脅迫處理的親本葉片ATP和ADP含量急劇下降，處理48 h時(shí)，比處理前分別下降了39．05%和42．03%，而“粵選1號(hào)”葉片的光合速率下降了25．31%和21．36%(圖3A、3B)，兩者間差異顯著(P≤0．05)．在高溫脅迫處理期間，葉片的AMP不斷增加，親本增加更迅速(圖3C)．

高溫脅迫前，“粵選1號(hào)”及親本EC值分別為0．72和0．71，沒(méi)有明顯差異，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，親本和“粵選1號(hào)”植株的能荷值EC值發(fā)生變化，48 h以后，“粵選1號(hào)”EC值高于親本，兩者差異顯著(圖3D)．

圖3 高溫脅迫對(duì)“粵選1號(hào)”和親本葉片的ATP、ADP、AMP含量及能荷的影響Figure 3 Effects of high temperature stress on the contents of ATP，ADP and AMP，and energy charge values in the leaves of“Yuexuan 1”and its parent plants

2．4 高溫脅迫對(duì)“粵選1號(hào)”和親本葉綠體M g2+-ATPase和Ca2+-ATPase活性的影響

高溫脅迫前，親本和“粵選1號(hào)”葉綠體的Mg2+-ATPase和Ca2+-ATPase活性沒(méi)有明顯差異(圖4)．處理48 h，親本的Mg2+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性分別比處理前下降了 20．81%和42．06%，而“粵選1號(hào)”只分別下降了 14．67%和18．27%，說(shuō)明“粵選1號(hào)”葉綠體在高溫脅迫下，2種類(lèi)型的ATPase活性有更強(qiáng)的耐高溫性．

3 討論

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，“粵選1號(hào)”葉片ATP含量與葉片光合速率相關(guān)性為 y=0．976x-1．524，R=0．969，表現(xiàn)出顯著的正相關(guān);同時(shí)，光合速率與能荷相關(guān)性為 y=27．997x-13．343，R2=0．981，說(shuō)明“粵選1號(hào)”光合速率與能量供應(yīng)密切相關(guān)，可能是“粵選1號(hào)”的光合速率在高溫脅迫過(guò)程中高于親本的原因之一．

圖4 高溫脅迫對(duì)“粵選1號(hào)”和親本的Mg2+-ATPase及Ca2+-ATPase活性的影響Figure 4 Effects of high temperature stress on Mg2+-ATPase and Ca2+-ATPase activities in“Yuexuan 1”and the parent plants

高溫脅迫條件下，“粵選1號(hào)”葉片能保持較高ATP和ADP含量，并維持較高的能荷參數(shù);而親本的ATP、ADP含量及能荷水平明顯降低．相關(guān)性分析也表明，葉片光合速率大小與ATP含量和能荷均有著正相關(guān)，能量供應(yīng)水平下降時(shí)，直接影響葉片的光合速率．這與前人對(duì)其他物種的研究結(jié)果相一致［3，5］．說(shuō)明能量供應(yīng)量是決定“粵選1號(hào)”和親本光合速率差異的原因之一．實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，高溫下，“粵選1號(hào)”葉綠體ATPase的活性均比親本高，高活性ATPase保證ATP順利合成，從而有充足的能量供給暗反應(yīng)，ATP供應(yīng)能力下降，必然影響葉片光合效率．因此，在高溫脅迫下，“粵選1號(hào)”葉綠體保持高活性的ATPase，才能保證ATP順利合成與供應(yīng)，維持高效的光合作用．

高溫脅迫下，“粵選1號(hào)”能維持較高的光合放氧速率，耐熱突變體PSII的光合放氧中心沒(méi)有受到高溫脅迫的破壞，保證對(duì)H2O正常的光解，這與前人在對(duì)高溫脅迫耐性不同的高粱品種上研究結(jié)果一致［13］．有報(bào)道指出，苜蓿在高溫脅迫下，其葉片的ATP含量和ATPase活性顯著下降，與葉綠體ATP供應(yīng)不足有關(guān)［14］;推測(cè)在高溫脅迫下只有保證H2O正常光解，才能維持葉綠體光合電子傳遞鏈正常的電子供應(yīng)，以保證葉綠體類(lèi)囊體膜內(nèi)外側(cè)正常的質(zhì)子電勢(shì)梯度，以利于進(jìn)行ATPase光合磷酸化，保證葉綠體內(nèi)多種代謝所需要的ATP供給．PSII受高溫脅迫損傷后，psdD蛋白快速合成需要大量的ATP供應(yīng)［15］．當(dāng)ATP供應(yīng)不足時(shí)，葉綠體基質(zhì)中的RuBP-case無(wú)法表現(xiàn)出正常的活性，使CO2固定無(wú)法正常進(jìn)行［16］．因此在高溫脅迫下，PSII是否穩(wěn)定直接影響到ATPase的活性及ATP的合成．

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