酶解條件對淀粉顆粒聚集態(tài)結構的影響*

羅發(fā)興 伍秀英 黃強 李超

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640)

作為自然界中最廣泛的儲能和供能物質(zhì)之一，淀粉因來源廣泛、價格低廉及可再生，被廣泛應用于各大工業(yè)及食品領域．淀粉是由葡萄糖單元經(jīng)糖苷鍵連接而成的大分子化合物，其顆粒由無定形區(qū)和半結晶區(qū)組成，其中無定形區(qū)由不規(guī)則排列的直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，而半結晶區(qū)由結晶層和無定形層交替形成．結晶層由支鏈淀粉側鏈形成的雙螺旋結構緊密排列而形成，也有部分直鏈穿插其中，使結構更緊密;支鏈淀粉的分枝點及直鏈淀粉則構成無定形層［1］．淀粉不僅能為人和動物提供能量，還能在低溫下酶解為葡萄糖和工業(yè)酒精等能源物質(zhì)，這一現(xiàn)象受到越來越廣泛的關注［2-3］．目前，有關淀粉顆粒酶解后結構變化的研究已經(jīng)較多，文獻［4-5］研究了不同種類的酶對同種淀粉結構的影響;文獻［3，6-8］研究了淀粉的種類及水解度對結構的影響．但是截至目前，關于不同加酶量和酶解時間下獲得的水解率相近的淀粉顆粒的聚集態(tài)結構差異的研究卻鮮有報道．文中以普通玉米淀粉為原料，通過改變加酶量和酶解時間來研究其對淀粉顆粒結構的影響，同時采用掃描電子顯微鏡(SEM)、差示掃描量熱(DSC)、小角X射線散射(SAXS)分析等方法對淀粉結構進行表征，以期為酶法淀粉改性提供理論指導．

1 材料和方法

1．1 材料

普通玉米淀粉，吉林中糧生化能源銷售有限公司產(chǎn)品;蘇宏葡萄糖糖化酶(酶活力為100000 U/mL)、ADN04390型中溫α-淀粉酶(酶活力828IU/mL)，諾維信(中國)生物有限公司產(chǎn)品;一水合檸檬酸、磷酸氫二鈉、3，5-二硝基水楊酸等均為市售分析純試劑．

1．2 實驗方法

1．2．1 淀粉的酶解

稱取一定質(zhì)量的普通玉米淀粉溶于pH值為5．0(pH值及反應溫度均根據(jù)兩種酶的最佳參數(shù)折中后獲得)的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中，配成23%(淀粉干基質(zhì)量分數(shù))的淀粉乳，加入一定量的復合酶(α-淀粉酶與葡萄糖糖化酶按體積比1∶3混合［8］)后于50℃恒溫水浴鍋中酶解，反應完成后，用5%(質(zhì)量分數(shù))的鹽酸調(diào)節(jié) pH值至3．0反應10min滅酶，用3%(質(zhì)量分數(shù))的NaOH中和溶液使pH值至6．0，真空抽濾，取濾液進行水解度測定，淀粉用去離子水洗滌3遍，抽濾，濾餅置于45℃的干燥箱中干燥48 h，粉碎，過80目篩，得到淀粉樣品．每個樣品重復兩次．通過控制加酶量或酶解時間得到水解率接近的微孔淀粉．

1．2．2 水解率的測定

水解率的測定參考文獻［9］的方法，得到標準曲線 y=6．7851x+0．0038，r2=0．9992．

1．2．3 SEM 分析

采用德國ZEISS公司生產(chǎn)的EVO18型掃描電子顯微鏡進行SEM分析．用導電雙面膠將淀粉均勻分散在樣品臺上，真空條件下將樣品噴金處理，置于掃描電子顯微鏡下觀察，放大2000倍觀察表面形態(tài)并進行拍攝．

1．2．4 DSC 分析

采用美國 Perkin-Elmer公司生產(chǎn)的DSC-8000型差示掃描量熱儀對淀粉樣品進行DSC分析．準確稱取3mg淀粉于實驗盤中，加入去離子水配成水分含量為75%(質(zhì)量分數(shù))的淀粉乳，封盤后放置12 h以平衡水分．以空盤為對照，然后以10℃/min的升溫速率開始掃描，掃描溫度范圍為30～100℃．用Pyris軟件計算起始溫度(to)、峰值溫度(tp)、終止溫度(tc)及相變焓(ΔH)等特征參數(shù)．

1．2．5 SAXS 分析

采用奧地利Anton Paar公司生產(chǎn)的SAXSess型小角X射線散射儀進行SAXS分析，將淀粉樣品與一定量去離子水混合，配成60%(質(zhì)量分數(shù))的淀粉乳，平衡8h后，置于毛細管樣品皿中進行測試．測試條件:波長 =0．1542nm，管壓40kV，管流50mA，樣品與影像板間距21．2mm，曝光時間10min．

2 結果與討論

2．1 酶解條件對淀粉水解率的影響

酶解時間與淀粉水解率的關系如圖1所示．由圖1可見，隨著酶解時間的延長，淀粉的水解率增大，按水解速度的快慢可將酶解過程分為兩個階段:前8h水解率增長較快;8h后水解速度減慢，這與文獻［10］的報道一致．這是因為在水解初期酶主要對無定形區(qū)進行水解，而后期主要作用于結晶結構，由于結晶結構較致密，因而水解速度減慢．

圖1 酶解時間與淀粉水解率的關系Fig．1 Relationship between hydrolysis time and hydrolysis degree of starch

加酶量與水解率的關系如圖2所示．由圖2可見，加酶量小于3．33×10-6L/g(以每克干基淀粉所加酶的量計)時，水解率的增長速度較快，當加酶量超過3．33×10-6L/g后，水解速度減慢，且基本保持穩(wěn)定．這可能是因為當加酶量低于3．33×10-6L/g時，酶主要作用于淀粉的無定形區(qū)，而當加酶量超過3．33×10-6L/g時，淀粉酶更多地向結晶區(qū)滲透進行水解，所以水解速度減慢．

圖2 加酶量與淀粉水解率的關系Fig．2 Relationship between the amount of enzyme and hydrolysis degree of starch

2．2 淀粉表面形態(tài)變化

微孔淀粉在不同水解條件下的水解率(DH)如表1所示，水解后淀粉的SEM分析結果如圖3所示．

表1 淀粉在不同水解條件下的水解率Table 1 Hydrolysis degree of starch samples under different hydrolysis conditions

圖3 不同水解條件下淀粉樣品的SEM照片F(xiàn)ig．3 SEM micrographs of starch samples under different hydrolysis conditions

由圖3可見，隨著水解率增加，淀粉表面微孔的孔徑增大，淀粉顆粒破碎程度加深，從破碎的顆粒中可看到明顯層狀結構，在較高水解率下，破碎的顆粒內(nèi)部出現(xiàn)大的空腔，與“由外至內(nèi)”和“由內(nèi)至外”的水解模式一致［11］．

比較加酶量和酶解時間不同、但水解率相近的樣品(B1與 B2、C1與 C2、D1與 D2)發(fā)現(xiàn)，加酶量多的樣品破碎程度更大，這可能是因為酶的增加導致淀粉表面開孔數(shù)增多［12］，淀粉顆粒結構減弱而破碎;比較水解率較高的D1、D2可發(fā)現(xiàn)，D2破碎程度更為明顯，但酶解時間長的D1中，淀粉顆粒中心部分更多地被水解，形成了大的空腔．

2．3 淀粉熱學性質(zhì)變化

不同淀粉樣品的熱學性質(zhì)參數(shù)如表2所示．由表2可見，隨著水解率的提高，to總體升高，這是因為酶進入淀粉顆粒后，優(yōu)先水解無定形區(qū)，從而導致殘余淀粉顆粒的to上升［6］．ΔH與淀粉乳在加熱過程中失去的雙螺旋結構及熔化的單螺旋結構有關［13］，從表中所示結果可見，ΔH隨著水解率升高而減小，這與文獻［4，6］的報道一致，這是因為淀粉酶在水解無定形區(qū)的同時也作用于半結晶區(qū)和結晶區(qū)，導致酶解后淀粉顆粒中的結晶總量減少，因此ΔH降低．

水解率均在39%左右的淀粉樣品D1和D2中，D1的ΔH更小，且與D2有顯著差異．這可能是因為水解時間為15．0 h的樣品顆粒內(nèi)部被水解得更多(從SEM照片中可看出)，導致顆粒中心擁有更長B鏈的支鏈淀粉構成的雙螺旋結構更多地被水解［14］，從而 ΔH 減小得更多．

表2 不同淀粉樣品的熱學性質(zhì)1)Table 2 Thermal properties of different starch samples

2．4 淀粉顆粒半結晶結構的變化

SAXS可用來測量聚合物中結晶顆粒的大小、晶粒形狀等．通過布拉格定律(d=2/q)可知:SAXS曲線的一個重要特征在于散射結構與對應的散射角間的負相關關系，其中d代表散射結構的尺寸或距離，q為相應的散射向量．淀粉的SAXS曲線在0．6nm-1左右出現(xiàn)的散射峰被認為與淀粉的半結晶區(qū)有關［15］，有研究者認為該峰的散射強度取決于半結晶區(qū)中有序結構的量或者無定形背景區(qū)和半結晶區(qū)(由重復的結晶層和無定形層構成)間的電子密度差［16］，Blazek 等［15］還認為無定形生長環(huán)的水解會導致SAXS曲線在低q區(qū)的散射強度增大．

不同淀粉樣品的SAXS結果如圖4所示．

圖4 不同淀粉樣品的SAXS曲線Fig．4 SAXS curves of different starch samples

從圖4可以看出，在低q區(qū)原淀粉的散射強度最小，經(jīng)水解后，淀粉在低q區(qū)的散射強度增大;比較水解率相近的淀粉(圖4(a)、(b))，可發(fā)現(xiàn)酶解時間長的樣品在低q區(qū)散射強度更大．而在0．6nm-1處的散射強度最大(4．44)，酶解淀粉的峰值強度減小，且4個酶解樣品中，酶濃度最小的樣品峰值散射強度最大(3．90)，其余3者沒有明顯差別．

酶解后淀粉樣品在低q區(qū)的散射強度增大，而峰值強度減小的實驗現(xiàn)象與之前文獻報道［14，17-18］的一致．Blazek等［15］認為這是酶對淀粉無定形生長環(huán)的優(yōu)先水解造成的．結合圖4，可認為在酶解過程中，淀粉的無定形生長環(huán)被優(yōu)先水解，且加酶量和酶解時間對淀粉結構的影響是不一樣的，提高加酶量主要影響半結晶區(qū)的水解，而延長酶解時間主要影響無定形區(qū)的水解．

另外，由散射強度峰值所對應的散射向量q，通過布拉格定律可計算淀粉中半結晶層的厚度d．從圖4可知，曲線的散射峰位置幾乎無變化，所以酶解對半結晶層的厚度沒影響．

3 結論

通過控制酶解時間和加酶量制得相近水解率的微孔淀粉，研究了兩者對淀粉顆粒聚集態(tài)結構的影響，得出以下結論:

(1)加酶量多、酶解時間短的微孔淀粉破碎程度高于加酶量少、酶解時間長的樣品;而后者淀粉顆粒的中心部分水解程度高于前者．

(2)隨著水解率的增大，淀粉的焓值(ΔH)減小，在較高酶解程度下，酶解時間長的微孔淀粉焓值下降更明顯，這可能與淀粉顆粒中心部分雙螺旋結構的水解程度有關．

(3)酶解過程中，淀粉無定形區(qū)和半結晶區(qū)結構均發(fā)生改變;提高加酶量和延長酶解時間對淀粉結構產(chǎn)生不同的影響，提高加酶量主要影響半結晶區(qū)的水解，而延長酶解時間主要影響無定形區(qū)的水解．

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