基于細(xì)菌酯酶活性的疊氮噻唑橙分子設(shè)計與特性驗(yàn)證*

余以剛 黃韻 李曉鳳 肖性龍 吳暉

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

食源性致病菌檢驗(yàn)的關(guān)鍵是食品中“活”的致病菌的存在性檢測和準(zhǔn)確定量［1］．目前用于區(qū)別活菌和死菌的標(biāo)準(zhǔn)主要有:是否可培養(yǎng)、是否有代謝活性以及細(xì)胞膜是否完整．分離培養(yǎng)法對于活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的細(xì)菌會出現(xiàn)漏檢［2］．EMA/PMA-qPCR活菌檢測技術(shù)利用新型核酸染料EMA(疊氮溴化乙錠)或PMA(疊氮溴化丙錠)滲入膜損傷的細(xì)胞后，與DNA發(fā)生共價結(jié)合，從而抑制膜損傷細(xì)胞DNA在PCR反應(yīng)中的擴(kuò)增［3］．該方法實(shí)際上是通過細(xì)胞膜的完整性來對“死”、“活”細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分檢測［4］．有研究表明，這種活菌PCR技術(shù)在方法和原理上仍存在不足［5-8］．細(xì)胞膜損傷可能是細(xì)菌死亡的一種極端表現(xiàn)形式，以細(xì)胞膜的完整性作為區(qū)分死、活菌的檢測標(biāo)準(zhǔn)存在缺陷．因此，建立一套基于生物代謝活性的活菌分析方法，使其既可有效檢測出活菌(包括VBNC菌)，又可克服EMA/PMA-qPCR方法在原理上的不足，對于膜完整或膜損傷的死細(xì)胞不檢測，這也符合致病菌檢測的根本要求．

為了通過細(xì)胞內(nèi)有無代謝活性來區(qū)分活、死菌，達(dá)到更精確的致病菌活菌檢測的目的，筆者設(shè)計了一種對細(xì)菌生物代謝活性敏感的新型噻唑橙熒光染料(簡稱TOMA)，它主要由3個功能基團(tuán)構(gòu)成:一是噻唑橙基團(tuán)(使分子可以自由穿透細(xì)胞)，二是疊氮基團(tuán)(在光照下與核酸共價結(jié)合后抑制核酸擴(kuò)增)，三是連接兩個基團(tuán)并含有一個酯鍵的柔性碳鏈(酯鍵對生物酯酶活性敏感，可被酯酶水解斷裂)．TOMA選取了具有細(xì)胞穿透性的菁染料作為DNA結(jié)合基團(tuán)，故可進(jìn)入所有細(xì)胞．利用帶酯鍵的碳鏈，可將染料基團(tuán)與疊氮基團(tuán)連接起來，而在酯酶水解作用下，兩個基團(tuán)可相互分離．在活性細(xì)胞內(nèi)，TOMA分子中的碳鏈被酶解斷裂，疊氮基團(tuán)從分子上脫落;反之，在無活性的細(xì)胞內(nèi)，疊氮基團(tuán)不會脫落，在可見光的作用下與 DNA共價交聯(lián)形成共價化合物，抑制DNA后續(xù)擴(kuò)增．而游離的TOMA分子，其疊氮基團(tuán)因在可見光作用下與水反應(yīng)生成羥胺而被鈍化．因此，結(jié)合TOMA與定量PCR(qPCR)技術(shù)建立新型活菌檢測技術(shù)來區(qū)分活、死菌，將依賴于細(xì)胞體內(nèi)的酯酶活性，而不是細(xì)胞膜完整性，理論上可比以往的活菌檢測技術(shù)更準(zhǔn)確．為建立以“細(xì)菌酯酶代謝活性”作為判斷細(xì)菌存活標(biāo)準(zhǔn)的活菌檢測技術(shù)，文中通過人工設(shè)計合成了TOMA分子，并嘗試在實(shí)驗(yàn)室條件下對TOMA分子的預(yù)期功能特性進(jìn)行了體外驗(yàn)證．

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)菌株與培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)所用菌株為金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)(ATCC6538)、大腸桿菌(Escherichia coli)O157:H7(ATCC6589)以及單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)(CMCC34761)，均為實(shí)驗(yàn)室保存菌種．

細(xì)菌培養(yǎng)采用LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl 10 g/L)，pH 值調(diào)至 7．0，培養(yǎng)基經(jīng)過121℃、20min滅菌后使用．將細(xì)菌分別接種到30 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37℃下180 r/min搖床中過夜培養(yǎng)16 h(OD600≈1)．液體培養(yǎng)基中添加1．5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂粉即得相應(yīng)的固體培養(yǎng)基，用于平板法測可培養(yǎng)菌數(shù)．

1．1．2 試劑及儀器

所用試劑均為分析純或色譜純;固定化脂肪酶Novozym435(固定化于大孔丙烯酸樹脂，酶活力10U/mg)購自丹麥 NovoNordisk Industries公司;細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司;PCR AmpLification Kit購自TaKaRa公司．

Waters 1525-ZQ2000型液相質(zhì)譜聯(lián)用儀、高效液相色譜儀、2996 PDA型檢測器，美國沃特世公司生產(chǎn);Bruker Biospin AG AV 600型核磁共振儀，瑞士布魯克拜厄斯賓有限公司生產(chǎn);Laica SP5型激光共聚焦顯微鏡，德國徠卡微系統(tǒng)有限公司生產(chǎn);鹵鎢燈，650W，購自德國Osram公司;臺式高速冷凍離心機(jī)，德國艾本德股份有限公司生產(chǎn);水浴鍋購自新加坡雷蒙特實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司;ABI7500型熒光定量PCR儀，購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司．

1．2 TOMA染料的合成

TOMA分子的合成路線如圖1所示，委托上海輝睿生物技術(shù)有限公司合成．目標(biāo)物經(jīng)合成與純化后，使用高分辨質(zhì)譜儀與核磁共振儀對分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證，粉末于4℃下避光保存．1H NMR(600MHz，d6-DMSO):δ1．33 ～1．42(m，2H，CH2)，1．54 ～ 1．63(m，2H，CH2)，1．84 ～ 1．89(m，2H，CH2)，2．28 ～2．36(t，2H，CH2)，3．38 ～3．43(t，2H，CH2)，4．14 ～4．18(t，2H，CH2)，4．57 ～4．63(t，2H，CH2)，6．92 ～6．96(s，1H，═CH)，7．34～7．38(d，1H，Ar-H)，7．40～7．44(t，1H，Ar-H)，7．57 ～7．63(t，1H，Ar-H)，7．72 ～7．76(t，1H，Ar-H)，7．77 ～7．80(d，1H，Ar-H)，7．95 ～8．01(t，1H，Ar-H)，8．04 ～8．08(d，1H，Ar-H)，8．11 ～8．14(d，1H，Ar-H)，8．62 ～8．66(d，1H，Ar-H)，7．87 ～8．83(d，1H，Ar-H)．

圖1 目標(biāo)化合物TOMA的合成路線Fig．1 Synthetic route of target compound TOMA

1．3 TOMA分子功能驗(yàn)證

1．3．1 TOMA對細(xì)菌胞膜的穿透性驗(yàn)證

稱取50mg TOMA粉末溶解于1 mL 20%(體積分?jǐn)?shù))的二甲基亞砜(DMSO)中，得到50 mg/mL的儲備液．向90μL無菌超純水中加入10μL TOMA儲備液，混勻，得到5mg/mL的TOMA工作液．

分別取500μL新鮮培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7以及單增李斯特菌菌液于1．5 mL離心管中，6000 r/min離心3 min，等體積無菌水重懸．菌液中加入TOMA工作液1μL使菌液中TOMA終濃度為10 μg/mL，充分混勻后，于室溫下暗處孵育10min．將離心管水平放置于冰上，于650W的鹵鎢燈下方20cm處進(jìn)行5min光照，期間輕輕搖晃冰盒保證溶液得到充分照射．陰性對照組使用無菌超純水代替TOMA溶液．

對經(jīng)TOMA處理后的菌體使用10%(體積分?jǐn)?shù))福爾馬林緩沖液進(jìn)行固定．吸取5 μL固定完畢的菌液，滴在無自發(fā)熒光的載玻片中央，加入甘油封片劑，蓋上蓋玻片后使用透明指甲油封閉．制成樣本后用激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果(激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長520nm，100倍油鏡)．

1．3．2 TOMA對脂肪酶的敏感性驗(yàn)證

酶處理?xiàng)l件:將0．238 g/L TOMA溶液5 mL(2．5μmoL)，于 40℃水浴中預(yù)熱 2min，脂肪酶用量0．5 ～3．5U，充分混勻后，于40℃、150 r/min 黑暗下處理20 min．濾膜過濾，濾液用于高效液相色譜(HPLC)分析檢測水解后產(chǎn)物(避光)．HPLC條件:色譜柱采用 Zorbax SB-C18柱(4．6 mm×250 mm，5μm);流動相為水∶乙腈 =60∶40(體積比)的磷酸鹽緩沖液(0．02 mol/L，pH 值 6．99 ～ 7．01);柱溫30℃;流量1mL/min;進(jìn)樣量10 μL;采用 PDA檢測器，激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長520nm．對照組中，使用等濃度未經(jīng)酶解的TOMA溶液代替酶解液．結(jié)果以降解率表示，計算公式如下:

降解率=(酶解前TOMA含量-酶解后TOMA含量)/對照組TOMA含量×100%．其中，TOMA的含量以mg/mL為單位計．

1．3．3 TOMA對DNA擴(kuò)增的抑制作用驗(yàn)證

分別取 500 μL金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7、單增李斯特菌菌液于1．5 mL離心管中，6000r/min離心3 min，收集菌體，等體積無菌水重懸．按照細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒操作說明提取基因組DNA．分別向提取的3種細(xì)菌DNA中加入 TOMA 溶液使終濃度達(dá)到 0．0、0．5、1．0、3．0、5．0、10．0、15．0、20．0 mg/L，充分混勻后于黑暗處靜置5min，然后側(cè)放于碎冰上，在鹵鎢燈下方約20cm處光照5min，使TOMA與DNA交聯(lián)，同時鈍化溶液中游離的TOMA分子．將經(jīng)過光照處理的DNA溶液作為實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)模板，考察TOMA對DNA擴(kuò)增的抑制作用．用DNAStar Seqman模塊(美國DNASTAR公司)對上述3種細(xì)菌分別進(jìn)行基因序列比對、用Primer Express 2．0(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)設(shè)計引物和探針．引物和探針序列如表1所示．

表1 引物和探針序列Table 1 Nucleotide sequences of primers and fluorogenic probes

熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，其中含10 ×Buffer 2．5μL、25mmol/L 的Mg2+溶液3．5μL、25mmol/L 的 dNTPs 1 μL、15 μmol/L 的前后引物各1μL、10 μmol/L 的探針 1 μL、模板溶液 2 μL、Taq DNA 聚合酶2．5U、DEPC 水12．5μL．反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2min，95℃變性5s，然后降溫至60℃并保持40s(收集熒光信號)，該過程進(jìn)行40個循環(huán)．反應(yīng)結(jié)束后40℃保溫2min．每個熒光定量PCR反應(yīng)各進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，計算平均Ct值(熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))和樣本標(biāo)準(zhǔn)差SD值．

2 結(jié)果與討論

2．1 TOMA分子表征與預(yù)期特性

PMA對DNA擴(kuò)增的抑制作用源于分子上連接的疊氮基團(tuán)，其在光作用下于原位與DNA發(fā)生共價結(jié)合，使DNA在PCR反應(yīng)中無法進(jìn)行復(fù)制，有效性早已得到廣泛承認(rèn)［9-12］．PMA分子完全不具細(xì)胞膜穿透性，但對一些具有可逆性的部分膜損傷細(xì)胞(如存在于環(huán)境樣本中的細(xì)菌)以及部分膜完整的活菌，染料仍會穿透細(xì)胞膜，造成假陰性檢測結(jié)果［13-15］．此外，對經(jīng)過紫外照射、冷凍滅菌等方法滅菌后仍保持細(xì)胞膜完整性的死菌，采用基于PMA的活菌PCR方法來評估會造成活細(xì)胞數(shù)目的嚴(yán)重高估，容易對檢測結(jié)果產(chǎn)生誤導(dǎo)［16］．文中設(shè)計合成的TOMA是在總結(jié)PMA作用原理的基礎(chǔ)上，利用噻唑橙類菁染料具有細(xì)胞膜通透性的特點(diǎn)，將PMA的功能與噻唑橙染料的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用．噻唑橙類染料能夠自由滲透細(xì)胞膜，本身無自發(fā)熒光，與核酸結(jié)合后熒光顯著增強(qiáng)．目前對這類染料的應(yīng)用主要集中在核酸熒光標(biāo)記定位方面．Carreon等［17］合成了4種結(jié)構(gòu)不一的菁染料，對細(xì)胞線粒體進(jìn)行了成像與定位．與已知的噻唑橙染料的結(jié)構(gòu)相比，TOMA在喹啉環(huán)的一側(cè)通過帶有單個酯鍵的柔性碳鏈連接了疊氮基團(tuán)，其相對分子質(zhì)量為474．6，吸收光譜在488nm，發(fā)射光譜在520nm，分子結(jié)構(gòu)經(jīng)高分辨質(zhì)譜儀及核磁共振儀表征無誤．在分子設(shè)計上，TOMA分子柔性碳鏈上的酯鍵更靠近疊氮基團(tuán)(而非噻唑橙基團(tuán))，目的是使成功被水解脫落的疊氮基團(tuán)分子更小，更有利于減小疊氮基團(tuán)脫落后與DNA發(fā)生交聯(lián)的概率．

TOMA的預(yù)期特性有3個:一是能自由穿透細(xì)胞膜;二是分子中的羧酸酯鍵能被生物體內(nèi)大量存在的酯酶水解;三是未經(jīng)酯酶水解的TOMA分子與DNA結(jié)合并發(fā)生交聯(lián)后，能抑制DNA在PCR反應(yīng)中的擴(kuò)增．

2．2 TOMA對細(xì)菌的透膜效果

用Laica SP5激光共聚焦顯微鏡(100倍油鏡，放大1000倍)觀察TOMA穿透細(xì)胞膜與細(xì)菌DNA結(jié)合的效果．結(jié)果顯示TOMA對3種細(xì)菌均具有良好的細(xì)胞膜穿透性，菌體經(jīng)TOMA處理后發(fā)出強(qiáng)烈熒光．使用TOMA對活的大腸桿菌O157:H7處理后的顯微圖像及未經(jīng)TOMA處理的大腸桿菌O157:H7的顯微圖像如圖2所示．

從圖2可見，菌懸液經(jīng)過TOMA處理后，TOMA透過細(xì)胞膜進(jìn)入菌體，與DNA發(fā)生特異性結(jié)合，所有菌體均產(chǎn)生了強(qiáng)烈綠色熒光，說明連接在TOMA分子上的疊氮基團(tuán)并沒有影響分子與DNA的結(jié)合以及熒光增強(qiáng)，TOMA與DNA結(jié)合后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度也沒有因?yàn)榀B氮基團(tuán)的存在而出現(xiàn)明顯下降．未經(jīng)TOMA處理的菌體未檢測出任何熒光．

噻唑橙類染料表現(xiàn)出與DNA的高結(jié)合率及結(jié)合后熒光強(qiáng)度的顯著增長，使其很適合作為DNA探針［18］．TOMA利用了噻唑橙染料可在細(xì)胞中自由擴(kuò)散、通過被動運(yùn)輸透過細(xì)胞膜的特性，因此對活細(xì)胞和死細(xì)胞的DNA和RNA都可以進(jìn)行結(jié)合染色(發(fā)出熒光)，對革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌的核酸亦均可結(jié)合染色．TOMA自身沒有熒光，是由于次甲基橋鏈兩端的苯并噻唑(頭部)和喹啉環(huán)(尾部)之間的自由旋轉(zhuǎn)造成的，當(dāng)有核酸參與時，頭部與核酸的小溝結(jié)合，尾部插入堿基中，迫使頭部和尾部發(fā)色團(tuán)位置固定，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)［19］．因此，通過顯微鏡觀察到，使用TOMA處理后細(xì)菌的菌體發(fā)出熒光，這可作為判斷TOMA成功結(jié)合菌體DNA的標(biāo)準(zhǔn)．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TOMA分子具有自由穿透細(xì)菌壁膜的特性，能夠成功穿透所有菌體細(xì)胞進(jìn)入菌體內(nèi)與DNA結(jié)合．TOMA對細(xì)胞膜的高穿透性，是利用TOMA建立起一套比PMA-qPCR檢測方法更準(zhǔn)確的活菌檢測技術(shù)的前提．

圖2 經(jīng)過TOMA處理和未經(jīng)TOMA處理的大腸桿菌O157:H7的熒光顯微圖像Fig．2 Fluorescence images of Escherichia coli O157:H7 with and without TOMA treatment

2．3 TOMA的酶活敏感性

TOMA采用帶有對酶活敏感的羧酸酯鍵的柔性碳鏈作為噻唑橙基團(tuán)與疊氮基團(tuán)的連接臂，是因?yàn)轷ッ冈诩?xì)胞內(nèi)普遍大量存在而且種類繁多．脂肪酶屬于酯酶下的一個亞類，基本上存在于所有的生物體中［20］，對維持生物體正常的功能運(yùn)轉(zhuǎn)有重要作用．目前已有成熟的基于活細(xì)胞酯酶活性的熒光染色試劑盒上市．如PromoKine公司的Live/Dead Cell Staining試劑盒，采用中性非熒光底物CTOMAein-AM對細(xì)胞進(jìn)行處理，CTOMAein-AM滲透入活性細(xì)胞內(nèi)后，分子的內(nèi)酯鍵(羧酸酯鍵)被非特異性酯酶切斷，生成不能穿過細(xì)胞膜的綠色極性熒光物質(zhì)而被阻留在細(xì)胞體內(nèi)［21］．

在5mL 0．238g/L TOMA溶液中添加不同量的固定化脂肪酶，40℃、150r/min下處理20min后，使用HPLC上機(jī)檢測．TOMA降解率隨脂肪酶用量(以每μmol TOMA中添加的脂肪酶的量計)的變化情況如圖3所示．

由圖3可見，酶用量在0．2 ～1．0 U之間時，TOMA的降解率隨酶用量增加呈上升趨勢，降解率與酶用量之間成簡單線性關(guān)系;繼續(xù)增加酶用量至1．2、1．4 U，降解率基本不發(fā)生變化，說明過量的脂肪酶并不能提高TOMA的降解效果;而酶量不足會直接影響TOMA的降解效率，這一點(diǎn)與TOMA分子設(shè)計的初衷相符合．因?yàn)楫?dāng)細(xì)菌喪失生物代謝能力時，TOMA在菌體內(nèi)將無法被降解，在后續(xù)的光照中疊氮基團(tuán)在原位與DNA進(jìn)行交聯(lián)，從而抑制DNA在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增．反之，在具有代謝活性的細(xì)胞中，TOMA中連接噻唑橙基團(tuán)和疊氮基團(tuán)的羧酸酯鍵被水解，疊氮基團(tuán)從分子上脫落，失去后續(xù)與DNA交聯(lián)的能力，對DNA擴(kuò)增無影響．對于VBNC菌，菌體的酶活性可能較低，適當(dāng)延長細(xì)菌與TOMA的孵育時間有助于反應(yīng)完全．此外，從圖3可以看出，本實(shí)驗(yàn)使用的脂肪酶最佳酶用量應(yīng)為1．0U，此時TOMA的降解率達(dá)到83%以上．

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TOMA分子中的酯鍵設(shè)計達(dá)到了預(yù)期目的．實(shí)驗(yàn)中TOMA分子上連接的酯鍵對酯酶活性表現(xiàn)敏感，可在短時間內(nèi)被脂肪酶水解，使疊氮基團(tuán)脫落．而酯酶在活細(xì)胞內(nèi)大量存在，因此，利用TOMA判斷細(xì)胞是否具有生物代謝活性是可行的．設(shè)計TOMA分子，是希望通過細(xì)胞生物代謝活性的有無，選擇性地抑制無代謝活性的細(xì)菌的DNA擴(kuò)增，從而達(dá)到對活菌進(jìn)行定量檢測的目的．

然而，不同屬不同株的細(xì)菌體內(nèi)表達(dá)的酶類與酶量之間有差異，不同存活狀態(tài)下細(xì)菌代謝活力也不盡相同．因此，對食源性致病菌體內(nèi)酯酶種類、活性進(jìn)行鑒定和測定后，探索幾種典型食源性致病菌在不同存活狀態(tài)下酯酶代謝活性水平的差異特征，從而進(jìn)一步優(yōu)化TOMA的使用方法，是下一步研究的方向．

2．4 TOMA對DNA擴(kuò)增的抑制效果

TOMA分子中的疊氮基團(tuán)與EMA/PMA中的疊氮基團(tuán)相同．當(dāng)分子在水溶液狀態(tài)下被光照時，疊氮基團(tuán)迅速失去自由氮產(chǎn)生活性氮烯，與水形成羥胺衍生物，當(dāng)分子處于與DNA結(jié)合狀態(tài)而非游離狀態(tài)時，由于氮烯對DNA的進(jìn)攻，分子的疊氮基團(tuán)與DNA形成共價鍵，從而在原位生成共價復(fù)合物［22］．與疊氮基團(tuán)共價結(jié)合后的DNA無法參與PCR擴(kuò)增．

TOMA濃度對DNA擴(kuò)增的影響如圖4所示．由圖4可見，3種細(xì)菌的DNA在PCR反應(yīng)中的Ct值均隨著TOMA濃度的增大而顯著增大，表明TOMA與DNA結(jié)合后，分子上的疊氮基團(tuán)對DNA擴(kuò)增的抑制效果明顯，并且抑制效果與TOMA濃度呈正相關(guān)．使用低濃度(0．5、1．0 mg/L)TOMA 處理的 DNA溶液，其PCR反應(yīng)后的Ct值與TOMA濃度為0的DNA溶液的相比增幅不大，說明使用過低濃度的TOMA對DNA擴(kuò)增的影響不大，因此，采用低濃度的TOMA在活菌檢測中可能會造成假陽性的結(jié)果．實(shí)驗(yàn)中TOMA濃度為10．0 mg/L時，TOMA對DNA的抑制作用明顯，此時Ct值達(dá)到36左右，繼續(xù)增大TOMA濃度至15．0 mg/L對Ct值僅有輕微影響．而當(dāng)TOMA濃度達(dá)到20．0mg/L時，整個PCR反應(yīng)過程無檢出，推測可能過高濃度的TOMA會對PCR反應(yīng)有抑制作用．實(shí)驗(yàn)表明，TOMA分子中連接的疊氮基團(tuán)在光照下能成功對DNA進(jìn)行共價交聯(lián)作用，在合適的濃度條件下能充分抑制DNA在PCR反應(yīng)中的擴(kuò)增．

圖4 TOMA濃度對DNA擴(kuò)增的影響Fig．4 Effect of TOMA concentration on DNA amplification

3 結(jié)語

文中設(shè)計合成了一種新型噻唑橙衍生物TOMA，并分別從3個方面對TOMA的預(yù)期特性進(jìn)行驗(yàn)證．結(jié)果表明:連接疊氮基團(tuán)的TOMA分子可以自由透過細(xì)菌的細(xì)胞膜;TOMA分子上的酯鍵能在酶作用下被快速高效降解;TOMA分子對DNA擴(kuò)增具有明顯的抑制作用．TOMA分子的預(yù)期功能特性在體外實(shí)驗(yàn)中得到了初步證實(shí)，為進(jìn)一步運(yùn)用TOMA對細(xì)菌進(jìn)行活菌檢測研究提供了重要參考．后續(xù)研究中，擬將TOMA與實(shí)時熒光PCR技術(shù)結(jié)合起來，利用死/活細(xì)菌體內(nèi)生物活性的差異來對致病菌進(jìn)行快速有效的檢測．由于TOMA對細(xì)菌體內(nèi)的生物活性敏感度高，TOMA應(yīng)用在致病菌活菌檢測技術(shù)中能同時克服傳統(tǒng)qPCR法假陰性和PMA-qPCR法假陽性的缺點(diǎn)，有效識別VBNC菌、非膜損傷死菌等，為致病菌活菌檢測手段提供新的方向．

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