中風(fēng)復(fù)元口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

★ 張誠(chéng)光 譚梅英 胥愛(ài)麗 李素梅（.廣東省第二中醫(yī)院 廣州 50095；.廣東省中醫(yī)研究所 廣州50095）

中風(fēng)復(fù)元口服液主要由黃芪、陳皮、赤芍、半夏等中藥組成，具有補(bǔ)氣活血，化痰通腑的功效，可用于中風(fēng)恢復(fù)期、后遺癥期治療中風(fēng)后肩手綜合癥，中風(fēng)后便秘等。為了更好地控制中風(fēng)復(fù)元口服液的質(zhì)量，本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)制定了科學(xué)可靠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)保證臨床用藥的有效性和安全性具有一定的價(jià)值和意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀，Alltech 3300蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，四元梯度泵，G2170AA數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；CAMAGTLCSCANNER III型薄層掃描儀（瑞士）；CAMAG TLC SAMPLER 4型自動(dòng)點(diǎn)樣儀（瑞士）；PBQ-II型薄層自動(dòng)鋪板器（重慶南岸實(shí)驗(yàn)電器廠）；電熱恒溫干燥箱：DHG-9070A（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；電子天平：BP-221D Sartorius（德國(guó)）；電熱恒溫水浴鍋：HWS-26（上海）；

1.2 試藥

黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)：110781-200613）、黃芪對(duì)照藥材（批號(hào)：120974-200609）、陳皮對(duì)照藥材（批號(hào)：120969-200507）、赤芍對(duì)照藥材（批號(hào)：121092-200402）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；中風(fēng)復(fù)元口服液由廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供；乙腈為色譜純?cè)噭ㄒ患?jí)），水為雙蒸水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 黃芪TLC鑒別 取中風(fēng)復(fù)元口服液10mL，加水飽和正丁醇振搖提取3次，每次15mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解作為供試品溶液。另取黃芪對(duì)照藥材2g，加水100mL，煎煮30分鐘，放冷，濾過(guò)，濾液加水飽和正丁醇振搖提取，同法制得對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-乙酸乙酯-稀氨水（1→10）（4：1：5）的上層溶液為展開劑，置于用濃氨試液預(yù)飽和15分鐘的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾（見(jiàn)圖1）。

2.1.2 陳皮TLC鑒別 取中風(fēng)復(fù)元口服液10mL，加乙酸乙酯振搖提取3次，每次15mL，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状?mL溶解作為供試品溶液。另取陳皮對(duì)照藥材0.3g，加乙酸乙酯30mL，超聲處理30分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL溶解作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液2μL，對(duì)照藥材溶液4μL，分別點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉制備的硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯（3：2）為展開劑，展開，取出，晾干，在105℃加熱3分鐘，置于紫外光燈（365nm）下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾（見(jiàn)圖2）。

2.1.3 赤芍TLC鑒別 取中風(fēng)復(fù)元口服液5mL，通過(guò)D101型大孔樹脂柱（濕法裝柱，內(nèi)徑8mm，柱高10cm），先用水洗脫至洗脫液近無(wú)色，棄去洗脫液，再用20%乙醇30mL洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用20%乙醇70mL洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取赤芍對(duì)照藥材0.5g，加水50mL，煎煮30分鐘，濾過(guò)，濾液濃縮至5mL，同法制得對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液15μL，對(duì)照藥材溶液3μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-氨水（6：3：1.5：1.5：0.3）為展開劑，置于用濃氨試液預(yù)飽和15分鐘的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸試液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾（見(jiàn)圖3）。

2.2 黃芪甲苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件[1]色譜柱：Agilent Hypersil ODSC18（4.6mm×250mm，5μm）柱；流動(dòng)相：乙腈-水（32：68）；流速：1.0mL/分；柱溫：25℃；漂移管溫度：45℃；氣體流速：1.5L/分；撞擊器模式：開。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成每1mL含黃芪甲苷0.512mg的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取中風(fēng)復(fù)元口服液20mL，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀?mL使溶解，放冷，通過(guò)D101型大孔吸附樹脂柱，（內(nèi)徑1.5cm，長(zhǎng)12cm），以水50mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取處方中除黃芪外其他藥材，按制劑工藝制備，按2.2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制得供試品陰性對(duì)照溶液。分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。從圖中可見(jiàn)，黃芪甲苷色譜峰峰形對(duì)稱，達(dá)到基線分離，陰性對(duì)照溶液在黃芪甲苷色譜峰處基本無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.2.5 線性范圍的考察 分別精密吸取不同濃度黃芪甲苷對(duì)照品溶液（每1 mL中含黃芪甲苷分別為0.0512μg，0.1536μg，0.2560μg，0.3584μg，0.4608μg）10μL進(jìn)行色譜測(cè)定，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，并以峰面積的自然對(duì)數(shù)值（Y）對(duì)進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)值（X）進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=1.3722X+5.0011，r=0.9995。表明黃芪甲苷在0.512-4.608μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液（0.512mg·mL-1）5μL重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積積分值的RSD為1.48%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品供試液（批號(hào)120201）分別于0，2，4，6，8小時(shí)進(jìn)樣5μL，測(cè)得樣品中黃芪甲苷峰面積值的RSD為1.84%，表明樣品供試液在8小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按擬定的含量測(cè)定方法，取同一批樣品（批號(hào)：120201）5份，分別制備供試液，測(cè)得峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果供試品中黃芪甲苷的RSD為1.32%。

2.2.9 回收率試驗(yàn) 取已知黃芪甲苷含量的同一批號(hào)樣品（120201）6份，置分液漏斗中，再分別精密加入一定量的黃芪甲苷對(duì)照品，按上述供試品制備方法，制備加樣回收供試品溶液并注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)試，結(jié)果黃芪甲苷的平均回收率為99.92%，RSD為1.67%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃芪甲苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.10 樣品的測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液2μL、5μL與供試品溶液各10μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品中黃芪甲苷含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

圖4 中風(fēng)復(fù)元口服液HPLC色譜圖（t/min）

3 討論

《中國(guó)藥典》2010年版一部第283頁(yè)黃芪項(xiàng)下收載有黃芪甲苷的提取、純化方法，采用此方法處理供試品，以正丁醇-乙酸乙酯-稀氨水（1→10）（4：1：5）上層溶液為展開劑，以濃氨試液飽和展開缸，所得色譜斑點(diǎn)清晰，供試品色譜與對(duì)照藥材色譜對(duì)應(yīng)良好，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，故列入正文。

《中國(guó)藥典》2010年版一部第176頁(yè)陳皮項(xiàng)下收載有薄層鑒別方法，但操作方法過(guò)于復(fù)雜，為簡(jiǎn)化方法，首先采用乙醚為提取溶劑，以甲苯-乙酸乙酯（3：2）為展開劑，結(jié)果供試品斑點(diǎn)較淺。將提取溶劑改為乙酸乙酯[2]，以5%三氯化鋁乙醇溶液為顯色劑，結(jié)果供試品色譜與對(duì)照藥材色譜對(duì)應(yīng)良好，斑點(diǎn)清晰，分離度好，且陰性無(wú)干擾，故列入正文。

《中國(guó)藥典》2010年版一部第147頁(yè)赤芍項(xiàng)下收載有薄層鑒別方法，采用此方法，結(jié)果供試品色譜背景較深，拖尾嚴(yán)重。采用大孔樹脂吸附法對(duì)供試品進(jìn)行純化[3]，以20%乙醇洗脫，將展開劑改為甲苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-氨水（6：3：1.5：1.5：0.3），以濃氨試液飽和展開缸，結(jié)果供試品色譜與對(duì)照藥材色譜對(duì)應(yīng)良好，斑點(diǎn)清晰，且陰性無(wú)干擾，故列入正文。

選擇方中君藥黃芪所含黃芪甲苷作為含量測(cè)定指標(biāo)，測(cè)定其含量以控制中風(fēng)復(fù)元口服液的質(zhì)量。參考《中國(guó)藥典》2010年版一部黃芪【含量測(cè)定】項(xiàng)下方法對(duì)中風(fēng)復(fù)元口服液樣品進(jìn)行處理并檢測(cè)，所得結(jié)果較為理想，峰形及分離度均良好，出峰時(shí)間亦較短，故選擇該方法作為黃芪中所含黃芪甲苷的含量測(cè)定方法。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].一部，北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

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[3]陳立江，段洪云，張勝，等.赤芍中芍藥苷的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2011，28（7）：634-637.