穴位埋線對衰老模型大鼠慢性應(yīng)激行為學(xué)及大腦皮質(zhì)的影響*

★ 邊心會 張 宏（1.廣東省廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院 番禺 511400；2.廣州中醫(yī)院大學(xué) 廣州 511400）

人體進(jìn)入老年階段以后，由于生理功能、機(jī)體代謝和組織形態(tài)變化，機(jī)體各系統(tǒng)都會出現(xiàn)不同程度的衰老征象，在形體外觀、行為學(xué)和大腦功能方面均出現(xiàn)一系列衰退變化。應(yīng)激是機(jī)體受到強(qiáng)烈刺激后出現(xiàn)的一系列神經(jīng)內(nèi)分泌免疫反應(yīng)，以及由此而引起的各種機(jī)能和代謝的改變。研究發(fā)現(xiàn)長期強(qiáng)烈的身心應(yīng)激可引起神經(jīng)內(nèi)分泌免疫功能的紊亂，嚴(yán)重影響人類的身心健康，加速機(jī)體的衰老過程[1-3]。本文旨在觀察慢性應(yīng)激對衰老機(jī)體行為學(xué)和大腦皮質(zhì)方面的影響及穴位埋線的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

健康3月齡SD雄性大鼠48只，SPF級，體重200-250g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。大鼠按體重隨機(jī)分為4組：空白對照組（A組）、模型組（B組）、模型+應(yīng)激組（C組）、模型+應(yīng)激+埋線組（D組），每組12只。大鼠均飼養(yǎng)于SPF級動物實(shí)驗(yàn)室，分籠飼養(yǎng)，每籠4只，飼養(yǎng)溫度21-24℃，光照時間為12小時左右，國家標(biāo)準(zhǔn)固體混合飼料喂養(yǎng)，自由飲食。

1.2 主要試劑與儀器

D-半乳糖（D-Galactose）由廈門興隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司提供；制動應(yīng)激器為有機(jī)玻璃制成，由河南省新鄉(xiāng)縣實(shí)驗(yàn)動物設(shè)備廠提供；醫(yī)用羊腸線為可吸收性外科縫線3-0鉻制，上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn)；DT-2000型電子天平：江蘇常熟雙杰測試儀器廠；光學(xué)顯微鏡由上海齊躍生物科技有限公司生產(chǎn)，型號：A-1。

1.3 模型制備

本實(shí)驗(yàn)過程共8周。B組、C組與D組連續(xù)8周給予腹腔注射5%D-半乳糖溶液（生理鹽水配制，120mg·kg-1·天-1），每天1次，A組每天給予腹腔注射等量生理鹽水；C組與D組從第5周開始給予制動應(yīng)激，應(yīng)激工具為由大鼠固定儀改制而成的限制活動筒。將造模大鼠置于應(yīng)激裝置中，應(yīng)激裝置以完全限制大鼠活動為度，應(yīng)激每天1次，連續(xù)應(yīng)激4周，并通過循序延長制動時間增加應(yīng)激強(qiáng)度。應(yīng)激時間分別為d1-d4：60分鐘/天；d5-d8：90分鐘/天；d9-d12：120 分 鐘/天 ；d13-d16：150 分 鐘/天 ；d17-d20：180 分 鐘/天 ；d21-d24：210 分 鐘/天 ；d25-d28：240分鐘/天。每天應(yīng)激時間安排在上午9：00-12：00。

1.4 埋線取穴與方法

D組從第1周開始給予穴位埋線，選取“腎俞雙”、“肝俞雙”、“百會”、“內(nèi)關(guān)雙”作為穴位埋線處方。“腎俞”和“百會一組，”“肝俞”和“內(nèi)關(guān)”一組，2組交替埋線。穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》（李忠仁主編，2003年中國中醫(yī)藥出版社）。將大鼠在清醒狀態(tài)下俯臥固定于大鼠固定架上，將醫(yī)用羊腸線剪成0.4-0.6cm數(shù)小段，用鑷子將其傳入7號注射針針頭中，然后將預(yù)先剪去針尖的2寸針灸針作為針芯緩慢插入注射針頭管中，組成一套。埋線時，穴位皮膚局部消毒后，將注射針頭刺入穴位，抵住毫針針尾，緩慢將針頭內(nèi)羊腸線推入穴位內(nèi)，待覺指下有空虛感后方可出針，并確認(rèn)羊腸線已埋入穴位內(nèi)，然后用消毒干棉球按壓針孔1分鐘。穴位埋線每周1次，共埋線8次。

1.5 行為學(xué)測定

（1）實(shí)驗(yàn)過程中觀察各組大鼠的毛發(fā)、精神、活動、飲食、體重等一般狀態(tài)。所有大鼠每天計(jì)量飲食量和飲水量，每3天稱重1次。

（2）open-field法測定行為：本實(shí)驗(yàn)所用敞箱為立柱體，高40cm，長寬均80cm，周壁為黑色，底面由面積相等的25個方塊組成，以大鼠穿越底面塊數(shù)為水平格數(shù)，大鼠的直立次數(shù)為垂直次數(shù)，以大鼠的理毛次數(shù)作為修飾次數(shù)，通過記錄大鼠在3分鐘內(nèi)的水平格數(shù)、垂直次數(shù)和修飾次數(shù)來比較不同組大鼠在新異環(huán)境中自發(fā)行為表現(xiàn)的差異。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第1天進(jìn)行敞箱實(shí)驗(yàn)。

1.6 標(biāo)本采集與制備

各組大鼠于第8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行稱重取材。所有大鼠腹腔注射麻醉（6%水合氯醛0.3mL/100g）后迅速斷頭，于冰盤中迅速開顱取右側(cè)大腦半球，稱重后放于甲醛溶液中固定24小時，取大腦顳葉部分常規(guī)石蠟包埋、冠狀切片（片厚約4μm）、HE染色，光鏡下觀察大腦皮質(zhì)形態(tài)學(xué)變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

B組大鼠與A組大鼠相比，出現(xiàn)了精神倦怠、動作遲緩、反應(yīng)遲鈍、毛發(fā)無光澤、飲食量減少和體重增長緩慢（P＜0.05）等表現(xiàn)；C組大鼠老化表現(xiàn)更加明顯（P＜0.01），部分大鼠甚至出現(xiàn)了便溏、尿頻、體重減輕等現(xiàn)象；D組大鼠的老化表現(xiàn)不明顯（P＜0.05）；體重增長差與A組之間比較無顯著性差異。詳見表1、圖1。

表1 體重增長差

圖1 各組大鼠體重增長情況比較

2.2 自發(fā)行為

與A組相比，B組、C組大鼠的水平活動次數(shù)、垂直活動次數(shù)和修飾次數(shù)都有明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）；D組大鼠水平活動次數(shù)、垂直活動次數(shù)和修飾次數(shù)較C組有明顯增多（P＜0.05）。詳見表2、圖2。

表2 open-field法行為測定比較

圖2 各組大鼠open-field法行為評定得分比較

2.3 大腦皮質(zhì)光鏡觀察（HE染色10×40）

光鏡下可見A組大腦皮質(zhì)細(xì)胞排列密集，細(xì)胞形態(tài)正常，胞核、核膜、核仁清晰可見；B組大腦皮質(zhì)細(xì)胞排列較稀疏，部分細(xì)胞出現(xiàn)固縮，體積減小；C組大腦皮質(zhì)細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞排列稀疏，細(xì)胞固縮嚴(yán)重，細(xì)胞間隙增大，甚至出現(xiàn)細(xì)胞核膜、核仁消失，體積減小，成均質(zhì)一片；而D組與C組相比，大腦皮質(zhì)細(xì)胞排列較密集，細(xì)胞形態(tài)有所改善。

3 討論

衰老是多基因（不變因素）和環(huán)境影響（可變因素）相互作用的亞臨床病理過程，這個過程的顯著變化之一就是生理功能減退和腦老化[4]。一方面，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“有諸于內(nèi)，必形于外”，年老以后由于五臟衰退，氣血虧虛，可出現(xiàn)發(fā)白齒槁、耳聾目花、皮膚干枯、反應(yīng)遲鈍、行動緩慢等外在行為的衰老表現(xiàn)，正如《內(nèi)經(jīng)》指出：“腎氣衰，發(fā)墮齒槁”、“精脫者耳聾”、“氣脫則目不明”。另一方面，大腦是人體的中樞器官，對生命活動有著極其重要的調(diào)控作用。腦為髓海，腎主藏精，肝主藏血，腎精肝血充足，腦髓得以充養(yǎng)，腦功能正常。然而隨著年齡的增長，人的大腦會出現(xiàn)生理性老化或病理性功能衰退，腦髓空虛，智力減退，亦在活動能力、思維能力、認(rèn)知能力、協(xié)調(diào)能力和興趣愛好等自主行為能力方面出現(xiàn)減退。臨床上表現(xiàn)出健忘、反應(yīng)遲鈍、動作不協(xié)調(diào)等癥狀，甚至喪失社會活動能力，生活不能自理，這是因?yàn)槟X在形態(tài)和功能上發(fā)生了退行性變化。

同時，老年機(jī)體由于生理功能出現(xiàn)退化，很難適應(yīng)各種超越平常狀態(tài)的內(nèi)外界的變化，即會出現(xiàn)應(yīng)激能力的下降。因此當(dāng)各種慢性應(yīng)激作用于老年個體后，就會加重老年個體在外貌特征、行為學(xué)、生理功能等方面的衰老變化和腦老化。有研究證明[5]，慢性應(yīng)激對大鼠的體重和行為有重要影響，不僅可抑制大鼠體重增長，還造成大鼠排便、排尿增多，活動頻繁，恐懼、焦慮情緒增高。

中醫(yī)理論認(rèn)為，慢性應(yīng)激主要通過影響人的心、肝、腎、腦等功能，使機(jī)體出現(xiàn)氣血流通不暢，臟腑功能紊亂，陰陽失調(diào)，加速機(jī)體的衰老。本實(shí)驗(yàn)選取腎俞、肝俞、內(nèi)關(guān)、百會作穴位埋線治療。因?yàn)楦斡岷湍I俞為肝腎兩臟的背俞穴，是臟腑氣血的匯聚地，能補(bǔ)腎疏肝、理氣和血、調(diào)節(jié)陰陽、強(qiáng)腰健骨。內(nèi)關(guān)為手厥陰心包經(jīng)絡(luò)穴，有益氣養(yǎng)心、安神除煩、寬胸理氣等作用。百會為督脈穴位，為三陽五會，與腦髓關(guān)系尤為密切，具有協(xié)調(diào)百脈之功。穴位埋線四穴，可疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)節(jié)平衡、益智復(fù)聰，提高抵抗力，改善學(xué)習(xí)記憶力。穴位埋線療法，是一種簡便易行的，融多種療法、多種效應(yīng)于一體的復(fù)合治療方法[6]。具有省時方便、作用柔和持久的特點(diǎn)。穴位埋線通過對穴位的刺激可以增強(qiáng)臟腑功能，調(diào)節(jié)衰老機(jī)體的整體功能狀態(tài)，提高抗應(yīng)激能力，從而起到延緩機(jī)體衰老的作用。

[1]Seckl JR.Gucocorticoids.ageing and nerve cell damage[J].JNeuroendocrinol，2000，12（8）：709-710.

[2]王曉英，包天桐.應(yīng)激與衰老的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國自然醫(yī)學(xué)雜志，2001，3（4）：199-202.

[3]韓娟.慢性應(yīng)激對大鼠下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)的影響及中藥的調(diào)節(jié)作用[J].吉林中醫(yī)藥，2002，22（4）：54-55.

[4]趙剛，蔡定芳.應(yīng)激糖皮質(zhì)激素和海馬老化[J].國外醫(yī)學(xué)·老年醫(yī)學(xué)分冊，2002，23（3）：125.

[5]鄭暉，楊權(quán)，吳彩茹.慢性應(yīng)激對大鼠行為和體重的影響[J].四川精神衛(wèi)生，2004，17（2）：71-72.

[6]尹改珍，霍新慧.穴位埋線療法現(xiàn)代臨床應(yīng)用[J].針灸臨床雜志，2006，22（10）：58.