分子標(biāo)記在馬鈴薯育種中的應(yīng)用

田再民，封生霞，籍立杰，馮 琰，馮莎莎

（1.河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，河北 張家口 075131；2.懷來(lái)縣農(nóng)業(yè)推廣學(xué)校，河北，張家口 075400；3.張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河北 張家口 075000）

傳統(tǒng)的育種主要依賴(lài)于植株的表型選擇，環(huán)境條件、基因間互作、基因型與環(huán)境互作等多種因素都會(huì)影響表型選擇。育種周期長(zhǎng)、不能預(yù)見(jiàn)育種結(jié)果，一個(gè)優(yōu)良品種的培育往往需要花費(fèi)7～8年甚至十幾年時(shí)間，隨著分子標(biāo)記在糧食、蔬菜及其他作物上的廣泛應(yīng)用，分子標(biāo)記育種取得了長(zhǎng)足的發(fā)展。與育種相關(guān)的遺傳標(biāo)記主要有4種類(lèi)型：①形態(tài)標(biāo)記，如馬鈴薯的葉型、抗TMV的矮黃標(biāo)記等形態(tài)性狀標(biāo)記；②細(xì)胞學(xué)標(biāo)記，以非整倍體、缺失、到位、易位等染色體數(shù)組、結(jié)構(gòu)變異為基礎(chǔ)的細(xì)胞學(xué)標(biāo)記；③生化標(biāo)記，利用基因的表達(dá)產(chǎn)物，如同工酶與貯藏蛋白，在一定程度上反映基因型差異；④分子標(biāo)記，指DNA標(biāo)記，是以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)，有以下優(yōu)點(diǎn)：表現(xiàn)穩(wěn)定，多態(tài)性直接以DNA形式表現(xiàn)，無(wú)組織器官發(fā)育期特異性，不受環(huán)境條件、基因互作影響；數(shù)量多，遍及整個(gè)基因組；多態(tài)性高，對(duì)目標(biāo)性狀表達(dá)無(wú)不良影響，與不良性狀無(wú)必然連鎖；部分標(biāo)記遺傳方式為共顯性，可鑒別純合體與雜合體，隨機(jī)分布在基因組內(nèi)，具有代表性［1］。

1 分子標(biāo)記的原理和方法

RFLP標(biāo)記，即限制性片?段長(zhǎng)度多態(tài)性，始于1974年Grodzicker等［2］，80年代開(kāi)始應(yīng)用于植物。是最早應(yīng)用于分子圖譜構(gòu)建、基因定位的分子標(biāo)記。其原理是基因組DNA經(jīng)限制性酶酶切產(chǎn)生不同長(zhǎng)度片

1.1 RFLP標(biāo)記

段的DNA，應(yīng)用凝膠電泳技術(shù)，將不同大小的DNA片段分開(kāi)，再經(jīng)Southern印跡轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，與經(jīng)過(guò)放射性同位素或生化試劑標(biāo)記的DNA探針進(jìn)行雜交，通過(guò)自顯影顯示出與探針雜交的特定DNA片段。此標(biāo)記結(jié)果比較穩(wěn)定，可以提供標(biāo)記位點(diǎn)完整的遺傳信息。但RFLP標(biāo)記所需DNA量大，檢測(cè)步驟復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。目前，RFLP標(biāo)記直接用于育種成本高，人們正致力于將RFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為PCR標(biāo)記，便于應(yīng)用。

1.2 RAPD標(biāo)記

RAPD標(biāo)記是由Williams和Welsh［3］在1990年研究的一種標(biāo)記，稱(chēng)為隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA。是以植物基因組DNA為模板，一段隨機(jī)的短的寡核苷酸序列作為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出多個(gè)片段的DNA，然后經(jīng)凝膠電泳把DNA片段分開(kāi)后形成多態(tài)性。RAPD分析所需DNA樣品少，實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求簡(jiǎn)單，分析樣品較大。但該技術(shù)最大的缺點(diǎn)是重復(fù)性不好，所得標(biāo)記是顯性標(biāo)記，不能區(qū)別顯性純合體與雜合體，它的應(yīng)用在一定程度上受到了限制。

1.3 AFLP標(biāo)記

AFLP是1993年建立起來(lái)的一種檢測(cè)DNA多態(tài)性的方法，即擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性［4，5］。其原理是對(duì)植物基因組DNA用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行切割，然后將人工合成的雙鏈接頭連到酶切片段末端，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增 （利用與接頭互補(bǔ)的特異引物），將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。AFLP技術(shù)結(jié)合了RFLP和PCR的優(yōu)點(diǎn)，快速簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性強(qiáng)、DNA用量少。AFLP技術(shù)廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、指紋圖譜的建立等研究中。

1.4 SSR標(biāo)記

1982年Hamada［6］等人發(fā)現(xiàn)。所有真核基因組中均含有一類(lèi)DNA堿基序列，被稱(chēng)為微衛(wèi)星或簡(jiǎn)單重復(fù)序列 （SSRs）。微衛(wèi)星標(biāo)記是一類(lèi)由1-6個(gè)堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列。對(duì)模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用非重復(fù)核苷酸序列設(shè)計(jì)的引物，所檢測(cè)的DNA核苷酸序列的多態(tài)性片段為SSR標(biāo)記。SSR標(biāo)記可鑒別出雜合子和純合子，重復(fù)性高，穩(wěn)定可靠，但開(kāi)發(fā)成本較高，為共顯性標(biāo)記。

1.5 ISSR標(biāo)記

1994年由Zietkiewicz等發(fā)現(xiàn)的一種簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記。是以SSR標(biāo)記為基礎(chǔ)而開(kāi)發(fā)的。其原理是用兩個(gè)相鄰SSR區(qū)域的引物，擴(kuò)增單拷貝序列，電泳檢測(cè)其產(chǎn)物的多態(tài)性。引物設(shè)計(jì)采用二個(gè)核苷酸、三個(gè)或四個(gè)核苷酸序列為基元。ISSR標(biāo)記結(jié)合SSR和RAPD的優(yōu)點(diǎn)，為顯性標(biāo)記，穩(wěn)定性和多態(tài)性較好。

1.6 SCAR標(biāo)記

1993年，Panran等［7］提出了一種將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化成特異序列擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記，即SCAR標(biāo)記。其原理是目的基因經(jīng)RAPD分析后，將多態(tài)性片段克隆，對(duì)克隆片段進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果，引物設(shè)計(jì)長(zhǎng)為18～24nt，原來(lái)的RAPD擴(kuò)增所用的引物在引物前10個(gè)堿基中包含部分。SCAR標(biāo)記所用引物長(zhǎng)，特異性擴(kuò)增重復(fù)性好，可有效用于分子育種。

1.7 STS標(biāo)記

STS標(biāo)記即序列標(biāo)記位點(diǎn)，1989年華盛頓大學(xué)的Olson等［8］人界定一段長(zhǎng)度為200～500bp的序列的位點(diǎn)。STS一般為共顯性或顯性標(biāo)記，在基因組中只出現(xiàn)一次。單拷貝的多態(tài)性DNA序列可以作為基因組的界標(biāo)轉(zhuǎn)化為STS標(biāo)記。它容易在不同組合的遺傳圖譜間進(jìn)行轉(zhuǎn)移、重復(fù)性好、有較高的可靠性。但STS標(biāo)記的開(kāi)發(fā)依賴(lài)于序列分析以及引物合成，目前成本太高?，F(xiàn)在，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)不同的限制性酶酶切后再進(jìn)行電泳，檢測(cè)其多態(tài)性，將STS標(biāo)記轉(zhuǎn)化成CAPS標(biāo)記。

1.8 SNP標(biāo)記

Lander E［9］于1996年提出的第三代DNA遺傳標(biāo)記，即SNP標(biāo)記。是同一物種不同個(gè)體間染色體上遺傳密碼單個(gè)堿基的變化，表現(xiàn)為基因組核苷酸水平上的變異，包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入、缺失等。SNP可分為編碼區(qū)與非編碼區(qū)SNP。有的SNP可產(chǎn)生不同的mRNA折疊方式，使mRNA合成、運(yùn)輸、成熟、翻譯或降解過(guò)程中相互作用的細(xì)胞組分發(fā)生變化，最終導(dǎo)致生物功能的變化［10，11］。非編碼區(qū)的SNP有的與調(diào)節(jié)基因的作用相關(guān)，有的則沒(méi)有關(guān)系。SNP標(biāo)記由于標(biāo)記數(shù)目多，隨著人類(lèi)對(duì)擬南芥、水稻等全基因組測(cè)序的完成，以及DNA芯片技術(shù)的日趨成熟，將具有廣泛的應(yīng)用前景，作為一種較理想的DNA標(biāo)記，受到越來(lái)越多的重視。

2 分子標(biāo)記在馬鈴薯育種中的應(yīng)用

2.1 遺傳圖譜的構(gòu)建

遺傳圖譜的構(gòu)建是植物遺傳育種的依據(jù)。高密度的遺傳圖譜是育種家追求的理想圖譜。遺傳圖譜構(gòu)建的環(huán)節(jié)為：依據(jù)遺傳材料之間的多態(tài)性來(lái)確定親本，建立作圖群體；作圖群體中不同個(gè)體的基因型進(jìn)行分析；應(yīng)用計(jì)算機(jī)的程序來(lái)構(gòu)建連鎖群。選擇合適的親本雜交及分離群體直接關(guān)系到建立圖譜的難易程度，是構(gòu)建理想的遺傳圖譜的關(guān)鍵。若親本間的差異太大會(huì)降低后代群體的結(jié)實(shí)率及影響圖譜的準(zhǔn)確性。遺傳圖譜主要應(yīng)用于植物基因組的結(jié)構(gòu)、進(jìn)化、功能、數(shù)量性狀、質(zhì)量性狀基因的定位等方面［12］。

中國(guó)關(guān)于馬鈴薯分子遺傳圖譜的研究較少。馬鈴薯所有的遺傳圖譜研究都在二倍體水平進(jìn)行。1988年，Merideth W B構(gòu)建了第一張馬鈴薯RFLP圖譜［13］，后來(lái)幾十張馬鈴薯分子連鎖圖譜公開(kāi)發(fā)表。1992年又構(gòu)建了一個(gè)密度更大的馬鈴薯RFLP圖譜。德國(guó)C.Gebhardt小組以馬鈴薯基因組隨機(jī)拷貝、cDNA和已知馬鈴薯基因?yàn)樘结?，?gòu)建總長(zhǎng)690cM，包含141個(gè)位點(diǎn)的馬鈴薯RFLP分子連鎖圖譜［14］。1995年，Van Eck等［15］建立了二倍體馬鈴薯的高密度的AFLP遺傳連鎖圖譜。AFLP是作圖效率最高的標(biāo)記［16，17］。1991年，Rouppevander Voort等［18］利用5個(gè)遠(yuǎn)緣二倍體繪制了連鎖圖譜，其中包含733個(gè)AFLP標(biāo)記。同時(shí)他們用2個(gè)回交群體構(gòu)建總長(zhǎng)度為1034cM，包括340個(gè)RFLP標(biāo)記和一個(gè)形態(tài)標(biāo)記的分子圖譜［19］。2001年，Chen等［20］建立了第一個(gè)馬鈴薯功能圖譜，包含69個(gè)基因，其中還有85個(gè)位點(diǎn)。通過(guò)功能圖譜與薯塊淀粉含量、新陳代謝QTL圖譜之間的比較，分析出一些與淀粉含量相關(guān)的候選基因。2001年，Luo等［21］建立了包含兩個(gè)同源四倍體親本及其后代群體的由SSR、AFLP標(biāo)記組成的分子連鎖圖譜，為馬鈴薯的數(shù)量性狀分析提供了方法。目前，中國(guó)在馬鈴薯農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀基因定位研究方面還有待進(jìn)一步加強(qiáng)。

2.2 重要性狀的基因定位

把具體的基因定位到染色體的特定位置上，指的就是基因定位。根據(jù)樣品的來(lái)源，有兩種常用的基因定位方法。第一，分離群體分群分析法。1991年，Michelmore等［22］提出了群體分離分析法，通過(guò)分析兩池內(nèi)DNA的多態(tài)性，可獲得與目的基因連鎖的分子標(biāo)記。具體方法是選擇親本進(jìn)行雜交，但是表型性狀應(yīng)該有一定的差異，通過(guò)F1代自交獲得性狀分離的F2群體，從F2群體的小群體中隨機(jī)取一定數(shù)量的個(gè)體，提取群體DNA，然后等量進(jìn)行混合，形成兩個(gè)基本相同的DNA池。第二，近等基因系法。是兩個(gè)親本雜交，親本間目標(biāo)性狀有差異，F(xiàn)1代與輪回親本多次回交后再自交獲得。該系其余基因大部分同輪回親本相同，多次回交耗時(shí)長(zhǎng)。對(duì)近等基因系、輪回親本的DNA或同工酶進(jìn)行多態(tài)性分析，找出兩基因組產(chǎn)物的差異，并以此為標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜，對(duì)目標(biāo)性狀定位。AFLP技術(shù)可檢測(cè)出DNA樣品間的差別，適合于與近等基因系或BSA分析相結(jié)合，尋找與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，并構(gòu)建目標(biāo)基因所在區(qū)域的精細(xì)遺傳圖和物理圖。

德國(guó)的Meksem等［23］利用F1群體及AFLP標(biāo)記，檢測(cè)到位于第5號(hào)染色體上的與馬鈴薯抗晚疫病緊密連鎖的標(biāo)記。Bendahmane等［24］利用AFLP標(biāo)記定位與Rx基因相距123cM的AFLP標(biāo)記。郜剛等［25］對(duì)兩個(gè)馬鈴薯二倍體群體ED和CE共140個(gè)基因型進(jìn)行青枯病人工接種鑒定，利用這種作圖群體進(jìn)行BSA分析，對(duì)抗性基因進(jìn)行篩選和定位，結(jié)果篩選到與抗病感病性狀基因定位在染色體XII上，與其相連鎖的標(biāo)記為3個(gè)RAPD標(biāo)記OPG05940、OPR11800和OPO13770，一個(gè)SSR標(biāo)記STM0032；檢測(cè)到與抗病性相關(guān)的7個(gè)AFLP多態(tài)性條帶，并為已有圖譜上的共性AFLP標(biāo)記，這些標(biāo)記可用于馬鈴薯分子育種。

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，將復(fù)雜的數(shù)量性狀分解為單一的遺傳組分，用單基因的效率來(lái)處理這些性狀，對(duì)數(shù)量性狀基因位點(diǎn) （QTL）作圖，將數(shù)量性狀基因繪制在連鎖圖上，找到與其緊密連鎖的分子標(biāo)記。Bradshaw等［26］分析了對(duì)囊線(xiàn)蟲(chóng)兩個(gè)四倍體親本及78個(gè)雜交后代，找到AFLP標(biāo)記與雙顯性抗蟲(chóng)主基因的QTL緊密連鎖，并定位于二倍體SSR遺傳圖譜中的第Ⅳ條染色體上，Rouppe等［27］將抗囊線(xiàn)蟲(chóng)的主基因定位于Ⅻ號(hào)染色體上。Collins等［28］對(duì)馬鈴薯晚疫病抗性基因進(jìn)行了QTL分析。

2.3 種質(zhì)資源研究

DNA指紋庫(kù)在糧食、經(jīng)濟(jì)、蔬菜作物育種中的應(yīng)用都十分廣泛，分子標(biāo)記可以用來(lái)建立DNA指紋庫(kù)。多態(tài)性標(biāo)記在同一物種的不同品種間大量存在，某一特定品種應(yīng)該具有區(qū)別于其他品種的特定標(biāo)記，這些特定的標(biāo)記就是一些特異性DNA片段的組合，稱(chēng)為該品種的 “指紋”，各品種的特定的指紋片段構(gòu)成該物種的DNA指紋庫(kù)。

測(cè)定親本間的遺傳距離、確定親緣關(guān)系是雜交育種親本選配考慮的一個(gè)重要因素。分子標(biāo)記特點(diǎn)就是受環(huán)境因素影響比較小，利用分子標(biāo)記可以快速鑒別親本之間的親緣關(guān)系。根據(jù)種質(zhì)資源DNA指紋的多態(tài)性，可對(duì)育種材料的變異程度作出具體評(píng)價(jià)。AFLP技術(shù)適合鑒定特定品種DNA指紋，它可以在較短的時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出大量的多態(tài)性標(biāo)記。Gregor等［29］建立了39個(gè)馬鈴薯栽培種的四種指紋圖譜，包括RAPD、AFLP、SSR和ISSR指紋圖譜，其中AFLP的效率最高，通過(guò)一次反應(yīng)獲得的多態(tài)性條帶最多。Milbourne等［30］利用AFLP技術(shù)分析多種四倍體馬鈴薯栽培種的遺傳關(guān)系。Knapova等［31］利用AFLP方法分析了134個(gè)晚疫病生理小種的表型和基因型結(jié)構(gòu)。AFLP技術(shù)還被應(yīng)用于馬鈴薯病原菌的研究。

作物品種包括具有較高的純度的F1代雜交，通過(guò)檢測(cè)品種是否具有其特有的標(biāo)記指紋片斷，可以有效對(duì)種子質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，來(lái)鑒定該品種純度。2001年，國(guó)際馬鈴薯中心指出，用不同的分子標(biāo)記，可以減少遺傳冗余材料，增強(qiáng)馬鈴薯各品種保存的可靠性，并鑒定重要的馬鈴薯材料以利于保存和提高。利用分子標(biāo)記對(duì)馬鈴薯的栽培種進(jìn)行分析，結(jié)果顯示SSR標(biāo)記比ISSR標(biāo)記更可靠和穩(wěn)定，而ISSR標(biāo)記比RAPD標(biāo)記有更大的多態(tài)性和穩(wěn)定性，研究表明使用3對(duì)SSR引物可區(qū)分50份馬鈴薯栽培種。Bryan等［32］將與野生種馬鈴薯抗孢囊線(xiàn)蟲(chóng)基因QTL定位在第Ⅴ連鎖群，采用的是AFLP標(biāo)記。Barone等［33］應(yīng)用AFLP技術(shù)對(duì)馬鈴薯四倍體體細(xì)胞進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果提高了鑒定的效率和準(zhǔn)確度。

3 展 望

馬鈴薯為無(wú)性繁殖作物，是四倍體遺傳。分子標(biāo)記技術(shù)在馬鈴薯遺傳育種有廣闊的應(yīng)用前景。如分子標(biāo)記輔助選擇、基因的定位、基因的分離等方面。前人在馬鈴薯中目標(biāo)基因的標(biāo)記、遺傳圖譜的構(gòu)建與種質(zhì)資源的研究等方面作了大量工作，然而還存在著一些不足，比如：開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記數(shù)量少，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，不容易發(fā)現(xiàn)與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，需構(gòu)建更為精密飽和的遺傳圖譜；檢測(cè)結(jié)果會(huì)有一些偏差（分子標(biāo)記技術(shù)本身的局限性）；馬鈴薯的基因克隆有待突破。傳統(tǒng)育種需要與分子標(biāo)記的有機(jī)結(jié)合，要在大田中驗(yàn)證分子標(biāo)記的結(jié)果和效應(yīng)。

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