脾臟樹突狀細(xì)胞的研究進(jìn)展

張江蘭，吳靖芳，邵素霞

（1.河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組胚教研室，河北 張家口 075000；2.河北醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河北 石家莊 050017）

脾臟是體內(nèi)最大的單個(gè)淋巴器官，約占全身淋巴組織總重的1／4，擁有大量免疫細(xì)胞，其中包括Mφ、樹突狀細(xì)胞 （dendritic cell，DC）、淋巴細(xì)胞等。DC是機(jī)體目前所知的功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，也是唯一能激活初始型T淋巴細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞，對機(jī)體T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)起至關(guān)重要的作用，在機(jī)體的免疫應(yīng)答中處于中心地位，并控制著體內(nèi)免疫反應(yīng)的進(jìn)展過程，因而成為腫瘤免疫反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。目前DC已經(jīng)成為生物治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，對DC的研究日趨深入而廣泛?，F(xiàn)就脾臟DC的研究狀況進(jìn)行簡要的回顧與展望。

1 脾內(nèi)DC的來源和分類

DC最初是Steinman和Cohn等1973年從小鼠脾臟中分離發(fā)現(xiàn)的，因其形狀具有樹突狀或偽足樣突起而命名。目前已經(jīng)陸續(xù)被人們一致認(rèn)為，凡細(xì)胞膜表面高表達(dá)MHC－Ⅱ類分子，并具有一些相對特異性表面標(biāo)志，有DC典型的形態(tài)，能移行至淋巴組織或淋巴器官，刺激幼稚型T細(xì)胞增殖活化的一類細(xì)胞可稱之為樹突狀細(xì)胞。DC為數(shù)量很少的一個(gè)群體，主要來源于髓系和淋巴系干細(xì)胞。淋巴來源的DC，主要分布于脾T細(xì)胞居住區(qū)；而骨髓來源的，主要起源于骨髓中的CD34＋多向性造血干細(xì)胞，發(fā)育為DC前體細(xì)胞 （pDC）后進(jìn)入外周血中，隨血液脾臟中歸巢，發(fā)育成未成熟DC。

根據(jù)部位的不同，脾臟的DC可分為三種［1］，一種為并指狀樹突狀細(xì)胞 （interdigitating DC，IDC）位于胸腺依賴區(qū)，即白髓內(nèi)T細(xì)胞區(qū)，動(dòng)脈周圍淋巴鞘內(nèi)層。IDC的星狀突起插入其他細(xì)胞之間，對抗原特異性T細(xì)胞具有很強(qiáng)的刺激作用；一種位于B細(xì)胞區(qū)的稱為濾泡DC（follicular dendritic cells，F(xiàn)DC），突起長而細(xì)，能在其表面較長期地保留抗原抗體復(fù)合物；一種位于邊緣區(qū)并延伸到紅髓內(nèi)，數(shù)量約占脾臟DC總量的75%［2］。根據(jù)刺激T細(xì)胞增殖能力的不同，按成熟情況分為未成熟DC （immature dendritic cell，imDC）和成熟DC （mature dendritic cell，mDC）。imDC缺乏或低水平表達(dá)許多重要的介導(dǎo)黏附和刺激T細(xì)胞的輔助分子，其在特異的細(xì)胞因子的作用下誘生為mDC，在炎性因子的驅(qū)化下，這些成熟的DC向T細(xì)胞區(qū)域遷移，啟動(dòng)免疫反應(yīng)。

2 脾臟DC的表面標(biāo)志

脾臟DC是一群異質(zhì)性細(xì)胞，表達(dá)不同表面分子的DC的含量和分布有所不同。大部分脾臟DC為imDC，具有活性的mDC含量較少。脾DC在不同的種屬、組織和不同的階段都有不同的表型。共同點(diǎn)為imDC低水平表達(dá)MHC-Ⅱ分子、共刺激分子CD80和CD86，炎性刺激可使imDC獲得成熟，并高表達(dá)MHC-Ⅱ、CD80和CD86分子［3］。在人脾臟DC除了表達(dá)這些分子外，還表達(dá)CD11c、CD83、CD205、CD209和HLA-DR。其中CD11c、CD205和CD209是目前較特異的人脾臟DC標(biāo)志物，imDC受到抗原刺激后，能很快在細(xì)胞膜表面表達(dá)HLA-DR［4－5］。小鼠脾臟DCs還表達(dá)CD11c、CD40和CD205，一旦DCs被激活，所有分子的表達(dá)水平將增高，并DC很快表達(dá)CD86分子，其中CD205是小鼠DC特異性標(biāo)志物。大鼠脾臟CD4＋和CD4－DC表達(dá)除表達(dá)CD80、CD86和MHC－Ⅱ分子外，還表達(dá)OX62，OX62是識別大鼠細(xì)胞膜表面的整合素αE2亞單位，其細(xì)胞質(zhì)可以合成一種為S-100的胞漿蛋白。近年來，陸續(xù)有人報(bào)道用檢測大鼠S-100蛋白來鑒別DC和Mφ，以及檢測大鼠脾臟中DC的形態(tài)學(xué)特征和分布情況，并提出S-100蛋白是郎格罕氏細(xì)胞、面紗細(xì)胞和交錯(cuò)突細(xì)胞等細(xì)胞系的一個(gè)標(biāo)志［6－9］。

3 分離與培養(yǎng)

在脾臟中單個(gè)的核細(xì)胞在總體細(xì)胞中所占的比例是比較少的，對于脾臟來源DC的分離和培養(yǎng)受到很多因素的影響，比如操作方法、培養(yǎng)時(shí)間、溫度、細(xì)胞因子用量、收集方式等，可采用免疫磁珠分離法并利用OX62單克隆抗體純化脾臟來源的DC，但是這種方法價(jià)格比較貴，不太適合大規(guī)模的培養(yǎng)和研究［10］。岳嘉寧等［11］對上述方法進(jìn)行改良，在制備大鼠脾細(xì)胞懸液的過程中，不使用研磨的方法對組織塊進(jìn)行處理，而采用膠原酶消化法，200目的濾膜過濾后，可以獲得的脾臟單細(xì)胞懸液量最多。隨后采用裂解紅細(xì)胞液去除細(xì)胞懸液當(dāng)中的大部分紅細(xì)胞。在密度梯度離心時(shí)，加入少量的FBS，可以對單個(gè)核細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)中使用EDTA來防止細(xì)胞的粘連。最后，每個(gè)脾臟獲得的細(xì)胞數(shù)均在108之上，使對脾臟來源的單個(gè)核細(xì)胞的提取達(dá)到了最大限度。

許化溪等［12］利用改良Steinman法提取小鼠脾臟DCs，無菌取脾臟用無血清RPMI1640洗兩次，于墊有200目無菌銅網(wǎng)的平皿中研碎，吸取銅網(wǎng)下細(xì)胞懸液離心，沉淀物再懸浮于無血清RPMl1640中，加至p＝1.080的Ficon一泛影葡胺細(xì)胞分層液上，離心后吸取低密度細(xì)胞層經(jīng)洗滌后用含5%FCS的RPMI1640制成懸液，并置細(xì)胞培養(yǎng)瓶中孵育，經(jīng)IgG包被的培養(yǎng)板親和粘附法除去FerR十細(xì)胞，DCs純度達(dá)80%以上。從脾臟分離出來的，貼壁生長的單核細(xì)胞可以通過誘導(dǎo)分化為DC。Yao等［13］將小鼠脾臟消化培養(yǎng)獲得了大于90%純度和95%生存能力的DC。近年來［10－13］的研究顯示，通過體外誘導(dǎo)和培養(yǎng)獲得的DC與從體內(nèi)純化的成熟DC的APC功能是一樣的，這樣就為更深一步的研究DC及其在臨床上的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

4 DC的免疫功能

4.1 誘導(dǎo)免疫應(yīng)答

DC作為在機(jī)體中起主導(dǎo)作用的抗原提呈細(xì)胞，在機(jī)體各免疫器官中都廣泛存在，是機(jī)體免疫反應(yīng)開啟的始動(dòng)細(xì)胞，也是機(jī)體抗原提呈細(xì)胞中最有效的成分，在這過程中起著關(guān)鍵的作用［14－15］。DC在機(jī)體免疫系統(tǒng)中充當(dāng)著崗哨的作用，不停在它外圍的環(huán)境中尋找抗原。在機(jī)體的內(nèi)部，對于從未接觸過抗原刺激的T細(xì)胞頻率約為10－4～10－8，數(shù)量是比較少的，都是初始型T細(xì)胞，不具有任何殺傷和增殖能力，也不能對其靶細(xì)胞產(chǎn)生有效的殺傷作用，只有靶細(xì)胞經(jīng)過APCs的加工處理和抗原提呈后，才能使T細(xì)胞被激活，并進(jìn)行增殖，產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，但是大多數(shù)DC在呈遞抗原后就會(huì)消失［16］。比如，心臟、腎臟間質(zhì)中的DC在局部獲取抗原后通過血液到脾臟；肝臟內(nèi)的DC通過血液獲取抗原后通過血液循環(huán)到脾臟［17］，激發(fā)抗原特異性的免疫反應(yīng)。DC移行到脾臟T細(xì)胞區(qū)定居下來，選擇出能將抗原特異性提呈的少量T細(xì)胞進(jìn)行克隆并激活它們，產(chǎn)生Th1介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，或通過激活B細(xì)胞產(chǎn)生體液免疫，清除具有抗原性的物質(zhì)。但Pulendran［18］研究發(fā)現(xiàn)，除產(chǎn)生Th1型應(yīng)答外，如果脾臟有Th2佐劑到達(dá)時(shí)，就會(huì)通過不同的TLRs活化脾臟中所有的DC亞群，結(jié)果是產(chǎn)生了Th2免疫應(yīng)答，并且能抑制CD8α＋DC，使其誘導(dǎo)Th1活化的潛能降低。

4.2 誘導(dǎo)免疫耐受

現(xiàn)研究表明，DCs具有雙重性，除可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，也具有免疫抑制作用。未成熟DC雖然具有強(qiáng)大的內(nèi)吞作用，但其抗原呈遞功能低下，能分泌多種細(xì)胞因子參與免疫耐受的形成。在機(jī)體沒有感染和沒有任何組織損傷的正常情況下，存在于周圍組織的imDC在不停地?cái)z取自身抗原及環(huán)境中的蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)機(jī)體外周免疫耐受，其作用機(jī)制主要有：①誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞無能，正常狀態(tài)下存在于機(jī)體周圍組織的imDCs不停的吞噬各種物質(zhì)，如自體的各種凋亡細(xì)胞，在機(jī)體中若缺乏Toll樣受體 （TLR）活化等DCs成熟信號時(shí)，DCs表達(dá)的主要組織相容性復(fù)合體 （MHC）分子和共刺激分子的量是很少的，會(huì)引起在周圍循環(huán)中相應(yīng)的T細(xì)胞失能；②誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，有報(bào)道［19］，Suss等在1996年發(fā)現(xiàn)脾中的CD8α－DCs是CD4＋T細(xì)胞大量增殖的誘導(dǎo)物，而CD8α＋DCs誘導(dǎo)的部分反應(yīng)與T細(xì)胞凋亡相關(guān)，這種凋亡是通過T細(xì)胞表面的Fas和DCs中的FasL相互作用實(shí)現(xiàn)的，同年，又發(fā)現(xiàn)CD8＋DCs通過限制IL-2的表達(dá)來調(diào)節(jié)初始型CD8＋T細(xì)胞的反應(yīng)；③誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞形成，imDC可以通過誘導(dǎo)具有抗原特異性的CD4＋或CD8＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 （T-reg）的產(chǎn)生，以抑制T細(xì)胞的增殖活化和Th1型細(xì)胞因子的分泌活動(dòng)［20］，從而使機(jī)體在正常的狀態(tài)下對自身的抗原和一些無害的外源性抗原形成免疫耐受。Yamazaki等通過實(shí)驗(yàn)研究［21］發(fā)現(xiàn)，CD8＋和CD205＋脾臟DC能特異性的誘導(dǎo)Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生。陳天宇等［22］證明在應(yīng)用抗大鼠DC單克隆抗體 （WZD）降低大鼠移植脾的免疫原性。在移植免疫學(xué)中供者不成熟DC傾向于引起免疫耐受，成熟DC傾向于引起免疫排斥的觀點(diǎn)已被大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DC的不均一性對移植免疫中排斥或耐受的調(diào)控具有相當(dāng)重要的作用［23］。有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)如果小鼠胸腺去除DC后，在體外進(jìn)行胸腺重建和培養(yǎng)過程中，加入胸腺或脾臟來源的DC均可導(dǎo)致T細(xì)胞發(fā)生免疫耐受，從而證明DC可誘導(dǎo)產(chǎn)生獲得性的特異性免疫耐受［24］。近來研究表明，脾臟DC表達(dá)的CD200R與體內(nèi)廣泛表達(dá)的CD200結(jié)合后可使DC分泌吲哚胺-2，3-雙加氧酶 （IDO），能夠誘導(dǎo)Tr活化而產(chǎn)生免疫耐受［25］。

5 DC與疾病關(guān)系

5.1 嚴(yán)重急性呼吸綜合征 （SARS）

戰(zhàn)軍等研究發(fā)現(xiàn)［26］SARS死亡患者脾動(dòng)脈周圍淋巴鞘高度萎縮，只留痕跡或完全消失；邊緣區(qū)變薄或完全消失；S-100是imDC表達(dá)的一種胞漿蛋白，SARS死亡患者脾內(nèi)白髓中S-100＋DC數(shù)較正常平均減少80.49%，有的甚至完全消失，可見SARS患者免疫系統(tǒng)的啟動(dòng)機(jī)制遭到嚴(yán)重破壞；CD83是mDC的表面標(biāo)志之一［27］，而未檢測到CD83＋mDC則提示SARS-CoV的入侵未能有效的刺激DC成熟。SARS患者免疫系統(tǒng)中抗原呈遞系統(tǒng)遭到嚴(yán)重破壞，SARS病毒不能引發(fā)DC成熟。

5.2 多器官功能障礙綜合征 （MODS）

在MODS早期［28］，脾DC大量增加并從脾臟白髓邊緣區(qū)向T細(xì)胞區(qū)遷移，從而與T細(xì)胞形成大面積的密切接觸，可以引發(fā)過度免疫反應(yīng)；MODS終末期［29－30］外周免疫器官脾及其DC嚴(yán)重?fù)p傷和功能耗竭，不同誘因所致MODS病例的病變基本一致。在MODS組的脾臟中發(fā)現(xiàn)S-100和CD1a陽性的DC數(shù)量是明顯高于正常對照組的，可見在機(jī)體遭受損傷和打擊后，啟動(dòng)了機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)。DC數(shù)量增加，但其形態(tài)多發(fā)生退變、溶解、萎縮或凋亡變性，在它們的外周常常伴有較多的凋亡淋巴細(xì)胞和凋亡小體存在，DC的功能發(fā)生減退或耗竭。在MODS的終末期，S-100、CD1a標(biāo)記以及電鏡所見到的DC數(shù)量增加很多，但大多數(shù)已經(jīng)不具備活性，呈免疫耐受的狀態(tài)，甚至?xí)鸬截?fù)向免疫調(diào)節(jié)的作用。

6 臨床應(yīng)用

近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞與DC融合、基因轉(zhuǎn)染和腫瘤抗原致敏等已經(jīng)成為腫瘤免疫治療中的有效途徑［31－32］。

6.1 融合細(xì)胞致敏DC疫苗

采用腫瘤細(xì)胞與DC相融合的辦法，腫瘤-DC融合細(xì)胞不但能提供DC的特異性抗原呈遞的功能，還能持續(xù)提供內(nèi)源性腫瘤抗原以進(jìn)入MHC－Ⅰ呈遞途徑。比如將脾來源DC與NS1細(xì)胞融合瘤苗免疫荷瘤小鼠后，可以激發(fā)其體內(nèi)存在的抗NS1腫瘤效應(yīng)。趙明耀等［33］用融合細(xì)胞瘤苗免疫治療荷瘤小鼠后，其瘤體消失，且在觀察期60d內(nèi)未見腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。

6.2 細(xì)胞因子基因修飾DC疫苗

細(xì)胞因子在DC的發(fā)育成熟，和DC對T細(xì)胞特異性抗原提呈的過程中發(fā)揮著重要的作用。如果將IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、TNF-α、INF-γ、G-CSF、GM-CSF等細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)入不同的腫瘤細(xì)胞，并以此對動(dòng)物進(jìn)行免疫，發(fā)現(xiàn)機(jī)體可以產(chǎn)生明顯的抗腫瘤免疫應(yīng)答。Cao等［34］研究發(fā)現(xiàn)若用GM-CSF修飾小鼠脾臟DC，并且與小鼠的黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行雜交后獲得的DC疫苗，可以誘發(fā)產(chǎn)生針對黑色素瘤的特異性CTL，使小鼠在受到黑色素瘤的攻擊過程發(fā)揮保護(hù)作用，其效果明顯要比用DC與黑色素瘤細(xì)胞雜交的疫苗好。Ogawa等［35］通過試驗(yàn)證明IL-2基因轉(zhuǎn)染脾臟獲得的DC和腫瘤細(xì)胞制備融合細(xì)胞能夠誘導(dǎo)出抗肺轉(zhuǎn)移的療效。

7 小 結(jié)

近年來，人們已經(jīng)對脾臟DC的生物學(xué)特性及免疫功能有了一定的了解，并且在部分疾病中應(yīng)用于臨床取得了一定的成果。脾臟DC作為機(jī)體最重要的專職抗原遞呈免疫細(xì)胞，在以T細(xì)胞識別腫瘤抗原為核心的腫瘤生物治療研究中展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。DC疫苗是腫瘤治療的第四模式［36］，是當(dāng)今癌癥治療方案的不可估量的補(bǔ)充，基因修飾的DC疫苗將會(huì)是一種很有實(shí)用前景的抗腫瘤方案［37］。我們相信隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們將對脾臟DC認(rèn)識的不斷深入，以DC為靶點(diǎn)的治療將為與免疫相關(guān)的多種疾病的治療提供新的途徑。

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