miRNA在腫瘤發(fā)生、診斷及治療中的研究進(jìn)展

夏海濱， 李 星

（陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安710062）

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于真核生物中的一類長18～26個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可通過與靶mRNA的3′UTRs（Untranslated Regions）近乎完全互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平使其降解或者與之不完全互補(bǔ)結(jié)合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而在基因表達(dá)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［1］．miRNA最早是在線蟲中觀察到的，包括lin－4和let－7［1］基因，線蟲的發(fā)育由這些基因所調(diào)控．隨后miRNA被發(fā)現(xiàn)在包括從線蟲到果蠅以及人的多種組織中存在［2］．目前，已發(fā)現(xiàn)6 000多個(gè)miRNA，其中包括超過600個(gè)人類的miRNA［3］．其中約1／3的蛋白編碼基因受miRNA調(diào)控［4］．miRNA的主要功能是調(diào)節(jié)生物體生長、發(fā)育和疾病發(fā)生過程中有關(guān)基因的表達(dá)．近來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，若干miRNA在各種腫瘤組織中的表達(dá)水平有不同程度上調(diào)或下調(diào)，這一現(xiàn)象表明miRNA在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平的異常，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要影響因素．

1 miRNA的生成

miRNA的生成依次在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，包括5個(gè)重要步驟：在細(xì)胞核中，編碼miRNA基因在RNA polⅡ （RNA polymeraseⅡ）的作用下，轉(zhuǎn)錄出具有莖－環(huán)結(jié)構(gòu)的初級miRNA（primiRNA）．Pri－miRNA在RNA聚合酶ⅢDrosha和輔助因子雙鏈RNA可吸附蛋白（Digeorge Syndrome Critical Region gene 8，DGCR8）的聯(lián)合剪切作用下，形成長度為60～70nt并含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA，即 前體miRNA（Pre－miRNA）［3］．Pre－miRNA在依賴Ran－GTP的Exportin5作用下從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中．在細(xì)胞質(zhì)中，RNA轉(zhuǎn)移內(nèi)切酶Dicer在TRBP和Ago2的協(xié)助下識別premiRNA雙鏈的5′末端磷酸基及3′末端突出．Dicer剪切發(fā)夾樣pre－miRNA形成22bp不完全互補(bǔ)的雙鏈．成熟的miRNA與其互補(bǔ)鏈結(jié)合成雙螺旋結(jié)構(gòu)，當(dāng)雙螺旋打開后，其中的一條會(huì)與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA－induced Silencing Complex，RISC）結(jié)合，形成非對稱RISC復(fù)合體 （Asymmetric RISC Assembly）．該非對稱RISC復(fù)合物能夠與目標(biāo)靶mRNA相結(jié)合［5］．

2 miRNA與腫瘤

近年研究發(fā)現(xiàn)約50%已知的miRNAs與多種人類腫瘤相關(guān)，表明其在腫瘤發(fā)生中具有重要作用．從已證實(shí)功能的miRNA來看，它們實(shí)際上可作為致癌基因或抑癌基因而發(fā)揮作用．據(jù)報(bào)道有些miRNA在腫瘤中表達(dá)是降低的，包括let－7、miR－15a／miR－16－1、miR－34、miR－10、miR－125、miR－143／miR－145等．有些miRNA在腫瘤中的表達(dá)是升高的，包括miR－17－92、miR－20、miR－21、miR－155等．下面將介紹至今研究較為深入的與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的miRNA．

2．1 let－7

let－7最早在線蟲中發(fā)現(xiàn)，它能夠調(diào)控細(xì)胞的分化和增殖的時(shí)序．研究發(fā)現(xiàn)let－7基因家族的表達(dá)水平在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中顯著下調(diào)，而且肺癌和乳腺癌中l(wèi)et－7a的表達(dá)水平與患者的生存時(shí)間呈正相關(guān)［6］．let－7家族編碼的miRNA是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的可以調(diào)節(jié)表達(dá)原癌基因RAS蛋白的miRNA．Johnson等在線蟲中利用RNA干擾技術(shù)，發(fā)現(xiàn)let－7能負(fù)調(diào)控其靶蛋白RAS［7］．此后Kumar等［8］通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)let－7可直接調(diào)控c－Myc的表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)let－7可與其靶基因RAS和c－Myc互補(bǔ)配對而下調(diào)RAS、c－Myc的表達(dá)，抑制其翻譯過程．目前研究已證實(shí)let－7miRNA表達(dá)譜在腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞中存在明顯差異，因此let－7 miRNA在腫瘤早期診斷方面可能有重要意義．Guled的研究表明，在惡性間皮瘤中，let－7b的表達(dá)呈上調(diào)趨勢，與此同時(shí)let－7e的表達(dá)量則進(jìn)行下調(diào)［9］．這提示let－7基因家族成員在同一細(xì)胞中具有不同的潛在的分化調(diào)節(jié)作用．

2．2 miR－15a／miR－16－1

研究發(fā)現(xiàn)miR－15和miR－16位于慢性淋巴白血?。–hronic Lymphocytic Leukemia，CLL）患者中易丟失的約30kb染色體片段中．在約50%的外套細(xì)胞淋巴瘤（Mantle Cell Lymphoma）、16%～40%的多發(fā)性骨髓瘤（Multiple Myeloma）和60%的前列腺癌（Prostate Carcinoma）中可檢測到這樣的缺失區(qū)［10］．提示在染色體13q14基因區(qū)域至少存在一種或多種腫瘤抑制基因．Cimmino等發(fā)現(xiàn)在約65%的CLL患者中miR－15a和miR－16－1發(fā)生缺失或表達(dá)下調(diào)［11］，與此同時(shí)BCL－2基因則呈過表達(dá)，miR－15a和miR－16－1的表達(dá)水平和BCL－2蛋白表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)．BCL－2蛋白在細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用，因此推測miR－15a和miR－16－1的缺失或下調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致BCL－2表達(dá)增強(qiáng)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生．

2．3 miR－34a／b／c

在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)miR－34家族包含3個(gè)miRNAs，分別是miR－34a、miR－34b和miR－34c．其中miR－34a定位于1p36上，而miR－34b和miR－34c共同分享一個(gè)轉(zhuǎn)錄本，定位于染色體11q23上［12］．在小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，miR－34a在腦部呈高表達(dá)，而miR－34b／c則在肺組織中呈高表達(dá)．Tazawa等研究發(fā)現(xiàn)，在36%的直腸癌和73%的前列腺癌中miR－34a的表達(dá)水平下調(diào)，在43%的非小細(xì)胞型肺癌中miR－34b發(fā)生下調(diào)．并且當(dāng)miR－34a的活性被抑制后，p53誘發(fā)的細(xì)胞凋亡率大幅下調(diào)，而過表達(dá)miR－34a的腫瘤細(xì)胞的成瘤能力明顯降低［13］．這些miRNA的異常表達(dá)同時(shí)下調(diào)多種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯［12］．因此，恢復(fù)miR－34的功能將被視為一條治療腫瘤的有效途徑．

2．4 miR－143／miR－145

miR－143和miR－145定位于染色體5q32－33D的脆性位點(diǎn)處［14］．在乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌、淋巴系統(tǒng)腫瘤及大腸癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞中miR－143和miR－145表達(dá)下調(diào)［15］．目前尚未發(fā)現(xiàn)miR－143和miR－145確定作用的靶基因，而潛在的基因包括有：信號傳導(dǎo)途徑中的基因，如Raf、RICS、G－protein γ7、HGK；基因表達(dá)的染色質(zhì)調(diào)控基因，如M96A，SMARCF1；蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和代謝過程的基因，如ATP1A1、GOLGA2、SMS、TMOD1、NUDT5、PAH、DHFR和MTHFR；處理加工RNA和蛋白質(zhì)的基因，如HNRPC、TXNDC4、ERP44等［15］．Chen等發(fā)現(xiàn)miR－143是通過抑制KRAS的翻譯來抑制結(jié)腸癌增殖的［16］．但 是Kulda［17］認(rèn)為miR－143在癌變細(xì)胞中的作用是非常復(fù)雜的，目前還難以確定miR－143究竟是抑癌或是致癌miRNA．

2．5 miR－155

miR－155定位于人染色體21q21，位于BIC基因241～262位之間［14］．與TS－miRs（Tumor Supressor－miRNAs）不同的是，致癌miRNA通常在腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并表現(xiàn)出增殖或抗凋亡活性．miR－155屬于最早被鑒定的致癌microRNA之一，它與非蛋白編碼基因BIC共表達(dá)．miR－155可以通過影響細(xì)胞因子的生成從而調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞的分化［18］，同時(shí)Rodriguez等［19］發(fā)現(xiàn)bic／mir－155能夠通過調(diào)節(jié)淋巴和樹突細(xì)胞的功能引起免疫應(yīng)答缺陷．Lee等研究發(fā)現(xiàn)在霍奇金淋巴瘤（HL）、原發(fā)性縱隔B細(xì)胞淋巴瘤（PMBL）中BIC的表達(dá)與miR－155的水平一致，提示BIC可能為miR－155的前體［14］．通常，在被激活的B細(xì)胞、T細(xì)胞和單核細(xì)胞中miR－155都有較高水平的表達(dá)［20］．Tam等曾在淋巴細(xì)胞瘤模型中驗(yàn)證BIC編碼的mRNA能與c－Myc相互作用促進(jìn)細(xì)胞增殖，并參與淋巴瘤的發(fā)生和發(fā)展，推斷BIC與c－Myc之間的相互作用是通過miR－155來實(shí)現(xiàn)的．因此，miR－155可能是作為癌基因與c－Myc協(xié)同發(fā)揮作用［21］．

2．6 miR－21

具有原癌基因活性的miR－21位于染色體的脆性區(qū)域17q23．2，它在大多數(shù)癌細(xì)胞中的表達(dá)均有上調(diào)［3］．已有的研究結(jié)果顯示，miR－21能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長并同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡．miR－21可以直接靶向PTEN使其下調(diào)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯下降．此外，miR－21也可靶向于一種促凋亡基因PDCD4［22］．通常miR－21在HCC中的表達(dá)是上調(diào)的，而PDCD4在肝癌細(xì)胞（HCC）中則是下調(diào)的．這表明miR－21可以同時(shí)通過靶向PTEN和PDCD4來抑制凋亡．近來研究表明，miR－21還可靶向于其他重要的腫瘤抑制基因，包括TPM1和SERPINB5［23］，提示miR－21也有可能在促進(jìn)腫瘤侵襲和遷移中扮演重要的角色．

2．7 miR－17－92

與miR－21一樣，miR－17－92是另一種在癌組織中高表達(dá)的miRNAs．miR－17家族包括7種miRNA：miR－17－5p，miR－17－3p，miR－18，miR－19a，miR－19b－1，miR－20以及miR－92－1［24］．miR－17家族位于人類染色體13q31上C13orf25基因初級轉(zhuǎn)錄本的第3個(gè)內(nèi)含子區(qū)．miR－17－92表達(dá)簇所在的13q31．3在多種類型淋巴瘤及實(shí)體瘤中經(jīng)常發(fā)生片段的擴(kuò)增．He等［24］發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的miR－17－92與c－Myc可共同誘導(dǎo)鼠B細(xì)胞淋巴瘤的生成及腫瘤組織中凋亡細(xì)胞的比例降低；而在單獨(dú)過表達(dá)c－Myc所誘發(fā)的淋巴瘤模型中，其組織中細(xì)胞凋亡的比例增加，表明miR－17－92可能具有阻斷c－myc誘導(dǎo)凋亡作用的功能．此外，O′Donnell等［25］發(fā)現(xiàn)，這些miRNAs在轉(zhuǎn)錄水平受到c－Myc的調(diào)控，在多細(xì)胞模型中，誘導(dǎo)c－Myc的表達(dá)可以增加miR－17的水平．他的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子E2F1是miR－17和miR－20的靶基因．E2F1既能通過激活DNA合成期的S期基因加速細(xì)胞增殖，也能通過ARF－P53途徑加速細(xì)胞凋亡．這些研究表明，miR－17－92家族主要是通過抑制抑癌基因和細(xì)胞周期調(diào)控基因的表達(dá)來誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生．

3 miRNA與腫瘤診斷

同正常細(xì)胞相比，某些miRNA在腫瘤組織及細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，因此miRNA有潛力成為腫瘤新的標(biāo)記，并有可能成為腫瘤診斷、預(yù)后的生物標(biāo)記物．RT－PCR、Northern－blot和microarray是研究這一方面的有力工具．Lee等［26］通過原位RT－PCR技術(shù)在胰腺細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR－221、miR－376a和miR－301有異常表達(dá)，而在基質(zhì)細(xì)胞、良性的胰腺腺泡或腺管中則未出現(xiàn)異常．Yanaihara等［27］發(fā)現(xiàn)hsamiR－155高表達(dá)和hsa－let－7a－2低表達(dá)與肺腫瘤的預(yù)后不良有關(guān)．Lu等［28］根據(jù)微珠流式細(xì)胞術(shù)建立的miRNAs表達(dá)圖譜，對腫瘤組織和正常組織的miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)不同腫瘤類型間的miRNAs的表達(dá)譜存在一定差異．利用miRNAs表達(dá)譜的不同對不同組織來源的腫瘤進(jìn)行單獨(dú)聚類．來源于上皮細(xì)胞的腫瘤如結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌和胃癌等可以歸為一類，顯示出miRNAs表達(dá)譜有助于人類腫瘤的組織分型．另外Lu等認(rèn)為，miRNAs可能會(huì)在決定細(xì)胞分化狀態(tài)方面起到進(jìn)一步的作用，將腫瘤組織的miRNAs表達(dá)譜與正常組織相比可確定這些細(xì)胞的分化程度．因此建立腫瘤miRNA標(biāo)簽或miRNA表達(dá)譜，將有助于對癌癥的診斷與治療．

4 miRNA與腫瘤的基因治療

miRNA作為腫瘤抑制基因?qū)τ谀[瘤的治療具有很大的影響．在腫瘤中，針對某些特定的miRNA的表達(dá)進(jìn)行干預(yù)可控制腫瘤的相關(guān)過程如細(xì)胞分化、增殖和凋亡等．近年來應(yīng)用miRNA治療腫瘤主要有兩個(gè)策略．一種策略是針對在腫瘤組織中下調(diào)的miRNA，導(dǎo)入相應(yīng)外源的miRNA以提升其表達(dá)，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和／或誘導(dǎo)其凋亡，如通過補(bǔ)充與天然miRNA序列相同的小分子可增強(qiáng)miRNA的 作 用．Takamizawa等［29］將 合成 的let－7補(bǔ)充到let－7低表達(dá)的肺腺癌細(xì)胞株A549中，抑制RAS蛋白的翻譯，腫瘤細(xì)胞的生長明顯受到抑制．這種方法與siRNA相比，由于前者來源于細(xì)胞基因組中，其序列相對固定，并且體內(nèi)存在miNRA表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，并由組織特異性啟動(dòng)子所控制，而siRNA由于是人工設(shè)計(jì)合成的一段小干擾RNA，使用siRNA進(jìn)行基因治療則會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生較大的免疫反應(yīng)．另一種策略是應(yīng)用反義技術(shù)抑制上調(diào)的miRNA．人們直接將化學(xué)合成的針對成熟miRNA序列的反義寡核苷酸（AMOs）用于腫瘤的治療研究．He等［24］發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)表達(dá)mir－17－92能夠有效抑制c－myc誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而加快腫瘤形成．而Krutzfeldt［30］等開發(fā)出一組拮抗miRNA的藥物，小鼠尾靜脈注射拮抗miR－16、miR－122、miR－192和miR－194的抗miRNA寡核 苷 酸（antagomirs）會(huì)導(dǎo)致小鼠肝、肺、腎、心、小腸、脂肪、皮膚、骨髓、肌肉、卵巢和腎上腺等組織中相應(yīng)的miRNA明顯減少．這種方法比其他抗腫瘤藥物更為穩(wěn)定且毒性小，可以有效的控制miRNA在各個(gè)器官中的活性．

5 miRNA的前景展望

目前miRNAs在動(dòng)物生長發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡及基因調(diào)控中的作用，引發(fā)了人們對miRNAs與腫瘤形成之間關(guān)系的思考．無疑抑癌與致癌miRNAs的發(fā)現(xiàn)將成為癌癥研究的新熱點(diǎn)．近年來人類對miRNA的認(rèn)識已取得很大進(jìn)展，大量新的miRNA被發(fā)現(xiàn)，對miRNA作用機(jī)制和一些基因的功能有了較為全面的認(rèn)識，并且已經(jīng)開始進(jìn)行miRNA在腫瘤等人類疾病的診斷和治療方面的探索．miRNA作為細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)調(diào)控表達(dá)中的關(guān)鍵因子，影響著多條信號傳導(dǎo)通路．通常一個(gè)miRNA可以影響多個(gè)靶基因，而一個(gè)靶基因又可受多個(gè)miRNA的調(diào)控．然而有關(guān)miRNA的研究還有許多難點(diǎn)，如miRNA存在時(shí)空表達(dá)特異性，不同類型腫瘤、同一類型腫瘤的不同階段其miRNA表達(dá)均存在高度時(shí)空特異性．再比如miRNA是通過什么信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方式與靶基因的mRNA的3＇端結(jié)合，并影響其翻譯功能．因此揭示miRNA的作用機(jī)制對于人們認(rèn)識體內(nèi)miRNA之間、miRNA與mRNA之間、miRNA與蛋白質(zhì)以及與DNA之間的網(wǎng)絡(luò)交互作用具有重要的意義．相信不久的將來，miRNA研究一定會(huì)有突破性進(jìn)展，從而推動(dòng)miRNA在腫瘤基因治療領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用．

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