分子生物學(xué)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

張秋楠

(大慶日月星有限公司 黑龍江大慶 163319)

2011年地溝油流向百姓餐桌,塑化劑大規(guī)模污染食品藥品,雙匯曝出瘦肉精事件,染色饅頭,富含亞硝酸鹽的血燕,蒙牛牛奶黃曲霉素超標(biāo),速凍食品中金黃色葡萄球菌檢出,讓人們越來越重視食品安全問題,微生物對食品的污染問題也相應(yīng)的備受關(guān)注。食品安全是在設(shè)計(jì)品生產(chǎn)、加工、儲存、運(yùn)輸、銷售等各個(gè)環(huán)節(jié)中確保食品衛(wèi)生和使用安全,降低疾病隱患,防范食物中毒的一個(gè)跨學(xué)科領(lǐng)域。在每個(gè)環(huán)節(jié)都有污染微生物的可能,微生物的污染會造成食品腐敗變質(zhì),或?qū)е率吃葱愿腥竞褪澄镏卸?。為了防止此類事件的發(fā)生,采用適當(dāng)?shù)臋z驗(yàn)方法檢驗(yàn)食品中的微生物就顯得十分必要,本文綜述了分子生物學(xué)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

1 PCR擴(kuò)增法

PCR法是分子生物學(xué)研究中最常用的技術(shù),從基因的擴(kuò)增,到基因的檢測,每個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室PCR儀是個(gè)必備工具。PCR技術(shù)利用設(shè)計(jì)出來的引物可以針對不同的基因,甚至通過設(shè)計(jì)簡并引物,我們可以將一類含有保守區(qū)段的基因擴(kuò)增出來。在食品微生物的檢測中,我們可以應(yīng)用細(xì)菌的各種菌種的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物,對我們從食品中提取出來的DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增,通過瓊脂糖凝膠電泳分離條帶進(jìn)行比對檢測。蔡亦紅等建立了腸毒性大腸埃希菌、傷寒沙門菌、福氏志賀菌三種致病菌的多重PCR技術(shù),通過對3種食源性致病菌的特異性基因片段的選擇,建立多重PCR體系并優(yōu)化。Kim等運(yùn)用多重PCR技術(shù)完成對大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌等的檢測。普通的PCR只能定性的檢測是否含有某些細(xì)菌基因的保守區(qū)段,目前通過對PCR方法的改進(jìn),或者擴(kuò)增條件的改變,已經(jīng)將PCR法應(yīng)用于定量的檢測。其中包括免疫捕獲PCR,熒光定量PCR等。

1.1 免疫捕獲PCR

免疫捕獲PCR是先通過免疫動(dòng)物從動(dòng)物的血清中獲得特異性抗體,然后通過ELISA法測定抗體的效價(jià),再將抗體固定在磁珠或者是管壁上,然后加入過夜培養(yǎng)的菌液,在食品微生物的檢測中,要用從食品中提取的菌液進(jìn)行孵育,最后加入PCR反應(yīng)試劑,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對擴(kuò)增的結(jié)果利用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,從電泳個(gè)圖譜中分析是否含有某種微生物。這個(gè)方法速度比較快而且準(zhǔn)確。

1.2 熒光定量PCR 法

熒光定量PCR是在1996年由美國公司發(fā)明的技術(shù),這項(xiàng)技術(shù)可以將原來的PCR的定性實(shí)驗(yàn),發(fā)展為定量實(shí)驗(yàn)。它就是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號的雞肋檢測PCR的進(jìn)程,最后利用曲線來對未知的摸板進(jìn)行定量分析的方法。目前,這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于很多食品中微生物的檢測,對食品中的阪崎腸桿菌,沙門氏菌,志賀菌,單增李斯特菌,金黃色葡萄球菌,乳酸菌等的檢測過程中都表現(xiàn)出了良好的可信度。

2 DNA指紋圖譜技術(shù)

2.1 DGGE

DGGE(變性凝膠梯度電泳)是在聚丙烯酰胺凝膠中加入變性劑(尿素和甲酰胺),在電泳時(shí)雙鏈DNA分子會因?yàn)樗瑝A基對不同,導(dǎo)致解鏈的溫度有差異,導(dǎo)致DNA分子在凝膠中的存在位置不同,形成不同的條帶,只要把電泳的條件改變的足夠精細(xì),哪怕是只有一個(gè)堿基差異的DNA分子也可以分開。在食品微生物的鑒定中,我們可以先從食品中提取DNA或RNA然后進(jìn)行PCR或RT-PCR的擴(kuò)增,然后利用DGGE凝膠電泳最后進(jìn)行譜帶分析,對條帶進(jìn)行測序后進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析最后分離富集。2004年J.Theunissen和TJ.Britz等人用DGGE法對南非益生茵食品進(jìn)行了抽樣檢查,確認(rèn)了食品中的微生物。Milica Nikolic等人通過PCR—DGGE的方法鑒定了山羊奶干酪中的乳酸桿菌。

2.2 RAPD 技術(shù)

RAPD是利用隨機(jī)引物,進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增DNA,擴(kuò)增出的DNA片段的大小和數(shù)量呈現(xiàn)多態(tài)性。這種方法有很高的敏感性和特異性,不同的微生物細(xì)胞中DNA不同,擴(kuò)增出的片段也各不相同,最后我們可以對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析,了解食品中的微生物的種類。G.Spano等利用RAPD技術(shù)將從紅葡萄酒中分離出的一個(gè)菌株確定為植物乳桿菌;Walczak等利用RAPD技術(shù)鑒定出非生產(chǎn)用酵母菌株與標(biāo)準(zhǔn)清酒假絲酵母菌株具有遺傳相似性。此外這項(xiàng)技術(shù)還可以應(yīng)用于金黃色萄球菌、大腸埃希氏、沙門氏菌和志賀氏菌。

2.3 AFLP

AFLP(擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析技術(shù))是利用限制性核酸內(nèi)切酶對基因組進(jìn)行酶切,不同的基因組酶切片段不同,然后對這些DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增得到的片段各不相同,利用瓊脂糖凝膠電泳或者聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析,會呈現(xiàn)片段的多態(tài)性。李海星等人運(yùn)用AFLP技術(shù)對發(fā)酵酸面團(tuán)中乳酸菌多態(tài)性進(jìn)行了研究。NairS等人利用AFLP對傷寒沙門菌進(jìn)行了分型。Aarts等在對62個(gè)血清型的78株沙門氏菌株進(jìn)行AFLP指紋分析發(fā)現(xiàn)所有的血清型都具有獨(dú)特AFLP指紋圖。Velappan等將單酶切AFLP技術(shù)(SE2AFLP)用于對Bacilli 亞群1,Yersinia,Staphylococcus和Escherichia coli菌種和菌株的鑒定。

3 結(jié)語

雖然分子生物學(xué)技術(shù)在食品微生物檢測中已經(jīng)顯現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景,分子生物學(xué)有著它自身的優(yōu)點(diǎn),例如精確度高,但是缺點(diǎn)是成本較高,隨著分子生物學(xué)的技術(shù)逐漸在改進(jìn),中國自主研發(fā)的試劑盒也會將分子生物學(xué)用在食品微生物檢測方面的成本更加低廉,使得分子生物學(xué)在食品微生物中的檢測中發(fā)揮重要的作用。

[1]蔡亦紅,姚余有.3種食源性致病菌的多重PCR快速檢測方法的建立.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2007,17(11):1959-1962.

[2]王永,趙新,蘭青闊等.4種食源性致病菌的PCR-SSCP檢測技術(shù)研究,2009,15(1):13-15.