馬腺疫快速診斷方法的建立與應(yīng)用

包拉提.吾木爾別克

(昭蘇縣畜牧獸醫(yī)站 新疆伊犁 835600)

馬腺疫是由馬腺疫鏈球菌引起的馬的一種接觸性的急性傳染病,驢駒易發(fā)此病,病菌隨膿腫破潰和病馬噴鼻、咳嗽排出體外,污染空氣、草料、水等,經(jīng)上呼吸道黏膜、扁桃體或消化道感染健康馬匹[1]。馬腺疫的潛伏期平均4-8天,由于馬匹體抵抗力的強(qiáng)弱和細(xì)菌的毒力以及數(shù)量的不同,其在臨床表現(xiàn)上也不同[2]。病馬特別是開放性鼻疽馬是主要傳染來源,該病主要經(jīng)消化道或經(jīng)損傷的皮膚粘膜而感染,因此常有同槽馬匹暴發(fā)本病的實(shí)例。在診斷中,傳統(tǒng)的診斷方法的步驟繁瑣,診斷效果也不太好[3]。本文具體建立了基于PCR的馬腺疫快速診斷方法,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌(E.coli)DH5α、大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)、pET22b(+)質(zhì)粒本實(shí)驗(yàn)室保存,馬鏈球菌Se39612基因本實(shí)驗(yàn)室提取。PCR擴(kuò)增儀(BioRad公司)、臺(tái)式高速離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)、UV9100紫外分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)、凝膠成像分析儀(BioRad公司)和臺(tái)式高速離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)。

1.2 馬鏈球菌Se39612基因的獲得

從屠宰場(chǎng)取病馬尸體,采取TRIzol法提取組織的總RNA。然后采用RT-PCR法獲得馬鏈球菌Se39612基因。RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù),首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成cDNA,再以cDNA為模板,擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛,可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平,細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。根據(jù)NCBI上已公布的馬鏈球菌Se39612基因序列,通過PrimerPremier10.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)兩條引物P1/P2,分別為馬鏈球菌Se39612基因上游引物P3(含有NdeⅠ酶切位點(diǎn))和下游引物P4(含有HindⅢⅢ酶切位點(diǎn))。用寶生物公司(大連)有限公司的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0把RNA合成cDNA,然后再對(duì)此cDNA進(jìn)行擴(kuò)增獲得馬鏈球菌基因。

1.3 馬鏈球菌Se39612表達(dá)載體的構(gòu)建

首先進(jìn)行原核表達(dá)載體pET22b(+)的質(zhì)粒提取,然后進(jìn)行重組質(zhì)粒的構(gòu)建,氯化鈣法制備新鮮的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,最后進(jìn)行ET22b/pSe39612重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)。

1.4 pET22b/pSE39612的蛋白表達(dá)

將pET22b/pSE39612菌液按1%接種量轉(zhuǎn)接至新鮮LB液體培養(yǎng)基后,繼續(xù)培養(yǎng)至OD600≈0.6時(shí)加入終濃度為1mmol/L的IPTG,誘導(dǎo)6h后收集菌體,12%SDSPAGE蛋白電泳檢測(cè)。將凝膠置于平皿中,加入考馬斯亮藍(lán)染色液G250,置于脫色搖床上輕輕搖動(dòng)2-3h,再將凝膠置于盛有脫色液的平皿中,于脫色搖床上脫色2-3h或過夜,其間更換多次脫色液直至背景清楚。用凝膠成像儀拍照保存。將構(gòu)建好的馬鏈球菌基因工程菌pET22b(+)/pSE39612接種于30mLLB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)12h,按1.0%接種量轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)其中培養(yǎng)至OD600≈0.6時(shí),加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6h后收集菌體。將菌體懸浮于硼酸硼砂鹽緩沖液中(pH8.4),冰浴中超聲破碎,離心后的上清液即為粗液,進(jìn)行western雜交分析。

2 結(jié)果

以病馬組織提取的總RNA為模板,用TaKaRa寶生物公司(大連)有限公司AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,通過RT-PCR法獲得馬鏈球菌基因。在1000bp處有一條帶,與預(yù)期大小1062bp相符。通過對(duì)重組尿酸酶基因工程菌的菌體進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè),在39.61kDa處有明顯的蛋白表達(dá)條帶,與馬鏈球菌Se39612蛋白的亞基相對(duì)分子質(zhì)量相同。Western分析檢測(cè)該蛋白與陽性血清反應(yīng)。

3 討論

馬腺疫是由馬腺疫鏈球菌引起的馬屬動(dòng)物的一種急性、熱性傳染病。4個(gè)月齡至5歲以內(nèi)的馬駒易感染馬腺疫,特別是1周歲左右的幼駒易感性最強(qiáng)。患病和病死動(dòng)物是主要傳染源,無癥狀和病愈后的帶菌動(dòng)物也可排出病菌成為傳染源[4]。在臨床表現(xiàn)上,初病馬精神沉郁,食欲減少,體溫升高到39℃-41℃。頜下淋巴膿腫破潰,流出大量膿汁,這時(shí)體溫下降,炎性腫脹亦漸消退,病馬逐漸痊愈。而如果病馬抵抗力很弱,加之治療不當(dāng),則本病原菌可沿淋巴管或血液轉(zhuǎn)移到其他淋巴結(jié)或器官,形成轉(zhuǎn)移性病灶,結(jié)果進(jìn)一步引起嚴(yán)重的全身癥狀。帶菌的馬匹在氣候突變、過勞、廄舍通風(fēng)不良、營養(yǎng)不良等因素影響下,使其抵抗力下降時(shí),可發(fā)生內(nèi)源性傳染。

從病原上分析,馬腺疫鏈球菌在膿汁中呈長鏈狀排列,本菌無運(yùn)動(dòng)性,不形成芽胞,但能形成莢膜。對(duì)外界環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)。在干燥膿汁及鼻液中能存活數(shù)周。在診斷中,常規(guī)需要綜合判斷,幼駒體溫升高(39℃-41℃)、頜下淋巴結(jié)腫大,隨著炎癥的發(fā)展,腫脹的淋巴結(jié)化膿破潰。采取膿汁,分離出鏈球菌,該菌不發(fā)酵蕈糖、山梨醇、甘露醇和乳糖,即可診斷為馬腺疫。在鑒別診斷中,必要時(shí)采取病馬的膿汁、鼻汁和實(shí)質(zhì)器官的化膿灶的膿汁涂片,堿性美藍(lán)染色,鏡檢出腺疫鏈球菌即可確診。而惡性型腺疫患畜,體溫呈稽留熱、貧血、黃疸,用抗生素及解熱藥治療效果不佳,易與馬傳染性貧血病混淆,但有典型的腺疫病史,白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)明顯增多。馬傳染性貧血病病馬的粘膜可能有出血點(diǎn),心臟機(jī)能紊亂,白細(xì)胞數(shù)接近正?；蚵詼p少,馬傳染性貧血抗體檢測(cè)陽性。頜下淋巴結(jié)硬固腫脹,無熱痛,不化膿,往往不能移動(dòng),且鼻疽有特征性的鼻疽結(jié)節(jié)和潰瘍,或放射狀疤痕,鼻疽菌素點(diǎn)眼試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)。

隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,基于分子生物的快速診斷方法在動(dòng)物疫情中的診斷得到了廣泛應(yīng)用。本文采用Trizol法從兵馬組織中提取細(xì)胞總RNA,通過RT-PCR法擴(kuò)增出馬鏈球菌基因,將馬鏈球菌基因轉(zhuǎn)化到E.coli.BL21(DE3)表達(dá)菌株的感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于含有Amp的LB平板上,倒置12-16h后挑取單菌落,提取質(zhì)粒和PCR驗(yàn)證,電泳檢測(cè)正確。將陽性轉(zhuǎn)化菌經(jīng)過轉(zhuǎn)接后誘導(dǎo)至對(duì)數(shù)生長期,加入誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),收集菌液進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè),發(fā)現(xiàn)明顯蛋白質(zhì)條帶,Western分析馬鏈球菌Se39612是有表達(dá)且有活性的。

而在馬腺疫鏈球菌的預(yù)防與管理中,對(duì)斷乳前后的幼駒及歲左右的馬匹,盡量做到全價(jià)飼養(yǎng),增加戶外運(yùn)動(dòng),秋、春季節(jié)防止幼駒受涼感冒等。在流行馬腺疫時(shí),對(duì)未發(fā)病的幼駒,可用磺胺類藥物預(yù)防。病初淋巴結(jié)輕度腫脹未化膿時(shí),為消除炎癥,促進(jìn)吸收,可應(yīng)用樟腦酒精、復(fù)方醋酸鉛等局部涂擦輕度刺激劑。如炎性腫脹嚴(yán)重,而且硬固而無波動(dòng),則于局部涂擦如一松節(jié)油軟膏等強(qiáng)烈刺激劑,促進(jìn)膿腫成熟。當(dāng)膿腫中心脫毛,有少量漿液滲出,觸之柔軟而有波動(dòng),應(yīng)及時(shí)切開,充分排出;嚴(yán)防病馬混入健康馬群,新引進(jìn)的幼駒應(yīng)隔離觀察2周。在春、秋氣候驟變易發(fā)病季節(jié),應(yīng)勤檢疫,發(fā)現(xiàn)病畜立即隔離治療。病畜廄舍和污染的用具等,應(yīng)用3%的來蘇兒等消毒。總之,基于PCR的馬腺疫診斷方法能快速進(jìn)行疫情的診斷與病情判斷,為疫情的預(yù)防與管理提供參考,具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

[1]柯春林,喬德亮,曾曉雄.獸疫鏈球菌莢膜多糖對(duì)免疫抑制鼠的抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性研究[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2011年23卷08期 18-22頁.

[2]唐芹芳,居會(huì)祥,金浩,等.從血液中分離出停乳鏈球菌似馬亞種1例[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008年18卷第06期.

[3]韓秀蘭,李云,董永輝.從一起暴發(fā)疫情分離的停乳鏈球菌似馬亞種檢測(cè)分析[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇,2004年10卷第06期.

[4]侯偉偉,肖倩茹,張麗,等.從血流中分離停乳鏈球菌似馬亞種1株[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2012年33卷第16期.