組織工程皮膚研究現(xiàn)狀

胡大海，王洪濤，王耘川，官 浩

第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍燒傷中心，燒傷與皮膚外科，陜西西安 710032

皮膚是人體抵御外界損傷的第一道屏障，也是燒傷、創(chuàng)傷過程中最易受損的器官。大面積皮膚缺損會引起體液喪失、水電解質(zhì)紊亂及低蛋白血癥、嚴(yán)重感染等，而皮膚移植是解決這一問題的關(guān)鍵。但由于自體/異體皮膚來源和應(yīng)用在某些情況下受到限制，人們一直在尋找理想的皮膚替代物。組織工程皮膚(tissue engineering skin，TES)為有希望解決這一問題的途徑之一。本文就當(dāng)前TES的研究、應(yīng)用進(jìn)展以及未來可能的研究方向作一綜述。

1 組織工程皮膚分類

種子細(xì)胞、支架材料以及細(xì)胞與支架材料相互作用的方式是構(gòu)建TES的3個基本要素，而TES從組織構(gòu)成上分為組織工程表皮(tissue engineering epidermis，TEE)、組織工程真皮(tissue engineering dermal scaffold，TEDS)和組織工程復(fù)合皮膚(tissue engineering composite skin，TECS)。根據(jù)移植后存活時(shí)間，TES可分為永久性和暫時(shí)性皮膚替代物。從支架材料上，TES分為生物材料和生物合成材料(包括生物可降解和不可降解材料)，此外，從構(gòu)建方法上又可分為體外和體內(nèi)構(gòu)建。

1.1 組織工程表皮 TEE主要是體外構(gòu)建的角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte，KC)膜片，種子細(xì)胞一般來源于皮膚組織活檢，通過體外擴(kuò)增培養(yǎng)3周左右形成細(xì)胞間融合的KC膜片。由于KC膜片沒有真皮支架支撐，細(xì)胞在創(chuàng)面上成活困難，移植修復(fù)的創(chuàng)面后期容易引起攣縮和瘢痕增生，因此目前多結(jié)合培養(yǎng)于生物可降解材料(如膠原或透明質(zhì)酸)、人或豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，以及人工合成的多聚高分子材料上，形成復(fù)合結(jié)構(gòu)再移植于創(chuàng)面。1989年美國Genzyme公司首先研發(fā)了自體KC膜片，而后有Epidex，Myskin等先后臨床應(yīng)用證實(shí)其能夠有效修復(fù)部分或全層皮膚缺損[1]。研究顯示，單純KC膜片應(yīng)用于慢性創(chuàng)面時(shí)只有15%左右細(xì)胞能夠錨定于創(chuàng)面并且繼續(xù)增殖和擴(kuò)增，移植于新鮮肉芽創(chuàng)面或者清創(chuàng)后創(chuàng)面，則有28%～47%細(xì)胞能夠維持生長，而移植于預(yù)制真皮支架或者有新生真皮創(chuàng)面，則有45%～75%細(xì)胞能夠維持生長[2－3]。因此，真皮支架在TES構(gòu)建過程中具有重要作用。

1.2 組織工程真皮 真皮基質(zhì)應(yīng)用于真皮缺失的創(chuàng)面修復(fù)，可明顯提高愈合質(zhì)量、改善愈合后的皮膚彈性及機(jī)械耐磨性、減少瘢痕增生及攣縮等。TEDS主要用來充當(dāng)修復(fù)愈合過程中創(chuàng)面缺失的真皮模版，引導(dǎo)自身修復(fù)細(xì)胞遷移、增殖和分化，完成真皮的重構(gòu)和血管化，一般由異體/異種脫細(xì)胞真皮和生物合成材料構(gòu)成。

1.2.1 自然生物材料 自然生物材料TEDS主要來源于異體/異種真皮，具有與人真皮相近的膠原和彈性纖維比例和三維空間結(jié)構(gòu)。未去除細(xì)胞的異體/異種生物材料一般只能存活10～15 d。因此，多用于創(chuàng)面的暫時(shí)覆蓋。有研究試用化學(xué)酶消化法或物理方法如反復(fù)凍融技術(shù)，去除異體/異種真皮基質(zhì)中的細(xì)胞以延長其存活時(shí)間，但往往難以徹底去除細(xì)胞成分，同時(shí)也會破壞細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜結(jié)構(gòu)?；啄な巧掀ね嫫せ|(zhì)間聯(lián)系和相互作用的重要部分。研究表明，KC的增殖、遷移以及分化依賴于基底膜中的層黏連蛋白和Ⅳ型膠原等，保存基底膜的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)更容易與表皮構(gòu)建成復(fù)合皮膚。目前研制應(yīng)用比較成熟的異體真皮基質(zhì)Alloderm采用的是NaCl-SDS脫細(xì)胞處理法，細(xì)胞去除徹底并保留了基底膜成分，臨床使用中證實(shí)Alloderm移植后能夠與創(chuàng)面基底整合，并可以長期存活而不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)[4]。

1.2.2 人工生物材料 主要應(yīng)用膠原、氨基葡聚糖(glycosaminoglycans，GAG)等，通過不同參數(shù)的物理冷凍、風(fēng)干、化學(xué)交聯(lián)等處理技術(shù)，制備不同孔隙率和空間有序的立體網(wǎng)格模擬人真皮結(jié)構(gòu)。另外，可以在制備過程中加載各種生長因子，促進(jìn)缺失真皮創(chuàng)面的修復(fù)與重構(gòu)。雖然在膠原分子螺旋結(jié)構(gòu)尾端含有可能引發(fā)免疫排斥反應(yīng)的端肽，但采用膠原制備的人真皮替代物臨床移植應(yīng)用顯示無免疫原性，沒有排斥反應(yīng)發(fā)生。成纖維細(xì)胞(fibroblast，F(xiàn)b)和 KC分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)以及巨噬細(xì)胞等均能分解膠原。因此，在制備膠原材料真皮時(shí)，加入某些化學(xué)交聯(lián)劑可以保持膠原的生物張力，避免快速降解，但化學(xué)交聯(lián)方法可能會影響Fb的增殖和遷移，從而延緩創(chuàng)面的愈合[5]。在膠原中加入GAG可以減少膠原酶對膠原的降解，增加膠原支架的穩(wěn)定性，優(yōu)化材料的機(jī)械張力等性能。另有研究顯示，在膠原支架構(gòu)建過程中，加載纖維連接蛋白、彈性蛋白、透明質(zhì)酸等也可進(jìn)一步增加膠原的穩(wěn)定性，同時(shí)提高移植后的真皮模擬效果，加強(qiáng)修復(fù)組織的生物學(xué)功能[6]。

1.2.3 生物合成材料 隨著材料科學(xué)和工程技術(shù)的發(fā)展，高分子生物可降解材料逐漸被應(yīng)用于TEDS的構(gòu)建，以聚羥基乙酸(polyglycolic acid，PGA)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)等為代表，模擬人體真皮構(gòu)建的三維支架，可以引導(dǎo)修復(fù)細(xì)胞增殖、遷移，同時(shí)隨著材料的緩慢降解，逐步被自身修復(fù)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)取代而完成創(chuàng)面的修復(fù)。人體細(xì)胞與合成支架材料的相互作用不同于自然情況下體內(nèi)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)間的作用，支架材料的成分、孔隙率及大小、降解速率和降解產(chǎn)物等直接影響細(xì)胞的黏附、增殖、遷移和分化。由于這些材料多是疏水性，無法提供修復(fù)細(xì)胞的黏附位點(diǎn)，影響了真皮的修復(fù)和重構(gòu)。因此，一些生物蛋白分子例如整合素結(jié)合受體RGD水凝膠等被整合入支架材料內(nèi)，用以增加細(xì)胞與材料的黏附性[7]。支架材料的降解為修復(fù)細(xì)胞遷移提供空間和趨化信號，其降解速率最好能與細(xì)胞的擴(kuò)增、遷移速率相匹配，整合素結(jié)合位點(diǎn)、MMPs活性和底物在這一過程中協(xié)同作用，而支架材料的孔隙率也影響著MMPs的活性。

1.3 組織工程復(fù)合皮膚 TECS主要是將培養(yǎng)的KC膜片和不同的真皮基質(zhì)在體外或體內(nèi)構(gòu)建成為具備全層結(jié)構(gòu)的皮膚，以達(dá)到修復(fù)創(chuàng)面、減少攣縮和瘢痕增生，改善修復(fù)后外觀和提高生理功能的目的。TECS研制的以Apligraf為代表，是將異體Fb接種于牛Ⅰ型膠原中并覆蓋異體KC膜片，但由于排斥反應(yīng)，只能作為暫時(shí)皮膚替代物。另外，比較有應(yīng)用前景的是 Boyce等[8]關(guān)于 Permaderm的研究，其設(shè)計(jì)以膠原海綿為基質(zhì)模擬真皮支架，接種自體KC和Fb，Permaderm尚沒有完成臨床轉(zhuǎn)化和廣泛推廣應(yīng)用。臨床應(yīng)用TECS移植修復(fù)創(chuàng)面常采用兩步法，即先將真皮支架移植于創(chuàng)面，3周左右待完全血管化后再移植自體刃厚皮片或KC膜片，可以有效提高移植成功率。

2 組織工程皮膚的研究方向

近年來，TES研究已取得很大的進(jìn)展，有些已經(jīng)應(yīng)用于臨床并取得良好的效果，但與臨床應(yīng)用中期望的TES相比仍有很大差距，主要是缺乏汗腺、皮脂腺等皮膚附件，以及移植后免疫排斥、人工合成材料的降解速率不可控等問題尚待解決。針對上述問題，今后的TES研究將會集中于干細(xì)胞的增殖和分化、移植后免疫調(diào)控和真皮支架材料仿生等方向。

2.1 干細(xì)胞與皮膚附件再生 TES與人體皮膚相比缺少汗腺、皮脂腺、毛囊等，而體內(nèi)外構(gòu)建過程中又很難將多種細(xì)胞整合于同一塊皮膚中，因此，人們不斷尋找新的具有多向分化潛能的種子細(xì)胞。干細(xì)胞因具有無限擴(kuò)增和多項(xiàng)分化潛能，為構(gòu)建含有或能夠誘導(dǎo)再生皮膚附件的全層TES帶來希望。干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)、成體干細(xì)胞(adult stem cell，ASC)和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)。ASC 由于取材容易，不涉及倫理問題，在TES構(gòu)建中受到重視。起初研究者認(rèn)為，ASC只能分化為相應(yīng)組織來源的成熟細(xì)胞，但后來大量研究顯示，ASC具有多向分化潛能，甚至可以分化為跨胚層組織細(xì)胞。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal stem cell，BMSC)是目前研究最多、應(yīng)用最廣泛的成體干細(xì)胞之一，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)BMSC可以向包括汗腺上皮細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞分化[9]。脂肪干細(xì)胞(adiposederived stem cell，ADSC)由于來源豐富、取材簡單、具有多項(xiàng)分化潛能而日益受到重視。ADSC具有與BMSC相似的表面標(biāo)記物，其中包括活化淋巴細(xì)胞黏附分子CD166和整合素β1等[10]，整合素β1與表皮干細(xì)胞黏附直接相關(guān)。雖然尚缺少ADSC大規(guī)模臨床應(yīng)用的報(bào)道，但體外和動物試驗(yàn)均已證實(shí)其具有多向分化潛能并能夠促進(jìn)創(chuàng)面愈合[11]。 此外，潛在的TES種子細(xì)胞來源是毛囊干細(xì)胞(Hair follicle stem cell，HFSC)。HFSC參與毛囊的周期循環(huán)，皮脂腺、汗腺的再生以及創(chuàng)面的愈合。HFSC沒有特異的細(xì)胞表面標(biāo)記物，但通常認(rèn)為K15和K19陽性細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。以HFSC為種子細(xì)胞構(gòu)建TES主要希望能夠再生毛囊、皮脂腺和汗腺[12]。iPSC是近年來的研究熱點(diǎn)，F(xiàn)b通過轉(zhuǎn)染4個轉(zhuǎn)錄因子基因 (Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc)，可以重編程轉(zhuǎn)化為類胚胎干細(xì)胞，并在一定誘導(dǎo)條件下向多種細(xì)胞分化。因慢病毒轉(zhuǎn)染仍存在一定生物安全性問題，使其進(jìn)一步臨床使用受到限制。于是研究者試圖采用非轉(zhuǎn)基因方法制備出iPSC。Zhou等[13]將多聚精氨酸轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域標(biāo)記蛋白重復(fù)加入含有丙戊酸的培養(yǎng)基中，成功應(yīng)用小鼠Fb制備iPSC。由于取材廣泛，如果能進(jìn)一步確定其生物安全性，必將是一個具有良好前景的TES種子細(xì)胞獲取途徑。

2.2 免疫排斥與移植物永久存活 研究顯示，TES的種子細(xì)胞不僅可以通過增殖、遷移、分化等直接參與缺損皮膚創(chuàng)面的修復(fù)，同時(shí)可釋放生長因子等參與新生皮膚的組織重構(gòu)。但預(yù)制的TES中應(yīng)用的異體種子細(xì)胞大多因在移植后的急性期排斥反應(yīng)中死亡。因此，如何保持外源細(xì)胞活力，減少排斥反應(yīng)，延長TES存活時(shí)間是一直以來的重要研究內(nèi)容，也將是今后相當(dāng)長一段時(shí)間內(nèi)TES領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來，間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)的免疫調(diào)控作用日益受到重視。研究顯示，MSC低表達(dá)Ⅱ型組織相容性抗原，因而被認(rèn)為是免疫豁免細(xì)胞;此外，MSC還通過多種方式參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[14]。研究證實(shí)，MSC可以抑制T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(natural killer，NK)、樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)的增殖，降低T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，抑制B淋巴細(xì)胞成熟和抗體分泌，抑制DC的成熟和活化，動員調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞(Treg)聚集于淋巴器官和移植物。炎癥反應(yīng)及其相關(guān)因子(TNF－α、INFγ)參與了上述過程的調(diào)節(jié)。研究顯示，PGE2、TGFβ、IL－6、IL－10、MMPs、吲哚胺 2，3 雙加氧酶(indoleamine 2，3 dioxygenase，IDO)等均可能參與了MSC的免疫抑制調(diào)控作用。因此，MSC作為TES種子細(xì)胞，有望參與創(chuàng)面修復(fù)的同時(shí)通過直接或分泌的方式調(diào)控免疫排斥反應(yīng)，獲得異體細(xì)胞和移植物長期存活的效應(yīng)。

2.3 支架材料仿生與智能化研究 TES的基質(zhì)支架可為種子細(xì)胞提供黏附、遷移、增殖、分化的微環(huán)境，并引導(dǎo)新生皮膚的組織重構(gòu)。在應(yīng)用人源性ADSCs治療糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，采用細(xì)胞懸浮液噴灑，對創(chuàng)面愈合沒有明顯作用，而將細(xì)胞接種于三維生物合成支架材料中移植，則能明顯加速創(chuàng)面愈合[11]，提示良好的基質(zhì)材料和支架結(jié)構(gòu)對于維持種子細(xì)胞生物學(xué)特性和功能具有重要作用。如何應(yīng)用生物材料模擬體內(nèi)微環(huán)境構(gòu)建具有最佳參數(shù)的結(jié)構(gòu)仿生基質(zhì)支架，是目前研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。計(jì)算機(jī)輔助高通量分析技術(shù)，可對不同條件下細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用方式進(jìn)行量化研究，為高效精確制備符合種子細(xì)胞生物學(xué)特性需求的三維基質(zhì)提供了基本條件[15]。

近年來，支架材料的智能化可控研究技術(shù)在不斷發(fā)展，研究者將生長因子微囊或微球整合于支架材料中，通過對微囊/微球的可控性設(shè)計(jì)制備，達(dá)到移植創(chuàng)面后依據(jù)愈合修復(fù)時(shí)相不同“有序”釋放所需生長因子，從而特異性調(diào)控種子細(xì)胞的遷移、增殖和分化。此外，通過細(xì)胞介導(dǎo)的酶化學(xué)反應(yīng)，在基質(zhì)材料降解過程中伴隨釋放生長因子分子[16]。這種方式更接近于體內(nèi)愈合過程，類似修復(fù)細(xì)胞遷移和增殖過程中，通過分泌MMPs有效降解細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而完成組織的重構(gòu)和生長因子分泌，因此是按修復(fù)細(xì)胞微環(huán)境需要的分子調(diào)控。在支架材料仿生研究領(lǐng)域，另一項(xiàng)值得提及的具有潛在發(fā)展前景的是3D生物打印技術(shù)。美國生物技術(shù)公司Organovo開發(fā)出一款生物打印機(jī)，可利用患者自身細(xì)胞“打印”皮膚。該3D生物打印機(jī)有2個生物“打印頭”，一個放置最多達(dá)8萬個人體細(xì)胞，被稱為“生物墨”;另一個可打印水凝膠“生物紙”，用作細(xì)胞生長的支架[17]。生物打印機(jī)可以利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，最大限度模擬人體正常皮膚結(jié)構(gòu)和需要，通過逐層累積打印，構(gòu)建全層組織工程皮膚。

3 結(jié)語

尋找理想的皮膚替代物一直是燒/創(chuàng)傷領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，TES為解決燒傷、創(chuàng)傷引起的大面積皮膚缺損的治療帶來新的希望，但目前與理想的TES尚有一定差距，主要是缺乏皮膚附件，存在免疫排斥，理化性能不穩(wěn)定等問題。但隨著對修復(fù)再生細(xì)胞局部微環(huán)境和生物學(xué)特性研究的深入，間質(zhì)與上皮之間相互作用、干細(xì)胞轉(zhuǎn)化等分子機(jī)制的不斷揭示，以及各種高分子材料和高新技術(shù)的應(yīng)用，未來的TES有望以干細(xì)胞為種子細(xì)胞，以“仿生智能化”生物高分子材料為皮膚支架，構(gòu)建出具有完整皮膚功能的理想組織工程產(chǎn)品。

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