菌種濾紙保存法的應(yīng)用

文德學(xué)，顧雪梅，王興林，胡忠惠，蘭興翠，李 瑩（.貴州省黔西南州人民醫(yī)院，貴州興義 56400；.貴州省興義市人民醫(yī)院，貴州興義 56400）

實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控工作需要保存各種質(zhì)控菌株，保證質(zhì)控菌株的穩(wěn)定是做好質(zhì)控工作的前提條件。保存菌種方法很多，根據(jù)不同的微生物菌株或不同的實(shí)驗(yàn)要求，可選用不同的保存方[1]。常見的有傳代培養(yǎng)保存法、液體石蠟覆蓋保存法、冷凍保存法、冷凍干燥保存法等[2－3]。銅綠假單胞菌、大腸埃希菌等許多非苛養(yǎng)菌質(zhì)控菌株都是生長條件要求不高的細(xì)菌，通常用斜面瓊脂培養(yǎng)基和半固體瓊脂培養(yǎng)基覆蓋石蠟油等方法均可很好保存，但是需要頻繁移種以保證存活率，而反復(fù)傳代又易導(dǎo)致細(xì)菌變異并造成菌種污染。一些常用的苛養(yǎng)質(zhì)控菌株如肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌等在斜面瓊脂培養(yǎng)基和半固體瓊脂培養(yǎng)基上不能存活，沒有條件的基層實(shí)驗(yàn)室難以保存這些苛養(yǎng)菌。在保存過程中必須使微生物的代謝處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，才能在一定時(shí)間內(nèi)使其不發(fā)生變異又保持很好的活性。作者借鑒應(yīng)用菌種濾紙保存法，基本滿足上述3個(gè)條件，實(shí)驗(yàn)證明是一種經(jīng)濟(jì)有效、簡便的菌種保存方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 自封袋：根據(jù)需要購買適宜大小的自封袋，也可使用試劑附送的自封袋。無菌EP管：將市售2cm直徑EP管置于密閉的消毒盒內(nèi)，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌25min備用。無菌濾紙條：將市售濾紙用剪刀剪成約0.5cm×1.0cm濾紙條置于帶塞的小試管內(nèi)，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌25min備用。菌種：銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、大腸埃希菌（ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）3株標(biāo)準(zhǔn)菌株購于衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，福氏志賀菌、枯草芽孢桿菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、豚鼠氣單胞菌、糞腸球菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、傷寒沙門菌、痢疾志賀菌、宋內(nèi)志賀菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、黏質(zhì)沙雷菌、嗜麥芽窄食單胞菌、甲型副傷寒桿菌、摩根菌、白色假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、肺炎鏈球菌、淋球菌、腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌、無乳鏈球菌、屎腸球菌、卡他莫拉菌、產(chǎn)單核李斯特菌、星座鏈球菌等31株菌株來自于臨床標(biāo)本分離的菌株，經(jīng)傳代分純培養(yǎng)而得。

1.2 儀器與試劑 血平皿及巧克力平皿：成品購于安圖公司，在適宜的貯存條件下、有效期內(nèi)使用；沙保羅斜面培養(yǎng)基：半成品購于杭州天合微生物試劑有限公司，按照說明書配制經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌25min后擺成斜面?zhèn)溆?；觸酶試劑：市售3%過氧化氫溶液，有效期內(nèi)使用，試驗(yàn)時(shí)金黃色葡萄球菌同步作陽性對(duì)照；膽汁溶菌實(shí)驗(yàn)試劑：取新鮮牛膽汁，無菌分裝（2毫升/管）密封置－20℃冰箱，可保存1年以上，試驗(yàn)時(shí)用肺炎鏈球菌平行做陽性對(duì)照；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：半成品購于杭州天合微生物試劑有限公司。按照說明書配制成成品肉湯后，分裝于有塞小試管，每管1mL，經(jīng)121℃25min高壓蒸汽滅菌后備用；－20℃冰箱：購于海爾公司的－20℃低溫冰箱；細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)儀器：購于美國BD公司的Phoein100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀。

1.3 方法

1.3.1 菌種保存 將目標(biāo)菌種在血平皿或巧克力平皿上劃線分離培養(yǎng)18～24h，獲取純凈菌落，然后用無菌眼科鑷夾取1張無菌0.5cm×1.0cm濾紙條，根據(jù)菌落大小，蘸取一到數(shù)個(gè)菌落（以粘菌面積不超過濾紙1/3，濾紙條尚未完全被水分浸濕為宜），放入無菌EP管中，蓋緊EP管蓋。根據(jù)需要，一次可制備數(shù)十條，1～2條裝1個(gè)EP管，貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽上注明菌種名稱，保存數(shù)量和保存日期，再置于自封袋內(nèi)，排盡袋內(nèi)空氣，封嚴(yán)袋口，放入－20℃冰箱保存。

1.3.2 菌種的生物性狀觀察和檢測 將上述方法保存的菌種于1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年、2年對(duì)應(yīng)時(shí)間取出上述各種菌株的一只菌種管直接置于室溫環(huán)境平衡5～10min，無菌操作取出相應(yīng)菌種濾紙條，放入無菌營養(yǎng)肉湯管中復(fù)溶，轉(zhuǎn)種在血平皿或巧克力平皿上35℃培養(yǎng)18～24h，觀察所保存的31株菌株的存活情況、菌落形態(tài)特征等有無變化；并對(duì)其中2株標(biāo)準(zhǔn)菌株：銅綠假單胞菌（ATCC 27853）和大腸埃希菌（ATCC 25922）在保存1年和2年時(shí)復(fù)溶轉(zhuǎn)種血平皿35℃培養(yǎng)18～24 h后，用Phoein100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀2次進(jìn)行生化鑒定和藥敏試驗(yàn)進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1 2009年5月保存17株菌株，分別是福氏志賀菌、枯草芽孢桿菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、豚鼠氣單胞菌、糞腸球菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、傷寒沙門菌、甲型副傷寒桿菌、卡他莫拉菌、摩根菌、產(chǎn)單核李斯特菌、無乳鏈球菌、屎腸球菌、星座鏈球菌；2009年7月保存5株菌株，分別是痢疾志賀菌、宋內(nèi)志賀菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、黏質(zhì)沙雷菌、嗜麥芽窄食單胞菌；2009年10月保存5株酵母樣真菌，分別是白色假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌、熱帶念珠菌、季也蒙念珠菌、光滑念珠菌。一共22株非苛養(yǎng)菌及5株酵母樣真菌，在保存到上述1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年、2年5個(gè)時(shí)間段時(shí)用營養(yǎng)肉湯復(fù)蘇分別移種到血平皿和沙保羅瓊脂斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24h，22株菌存活率均為100%，菌落形態(tài)特征無明顯改變且生長良好。

2.2 2009年7月保存2株菌株，分別是肺炎鏈球菌和淋球菌。肺炎鏈球菌在上述1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年、2年5個(gè)時(shí)間段用營養(yǎng)肉湯復(fù)蘇移種血平皿經(jīng)35℃、5%二氧化碳（CO2）環(huán)境培養(yǎng)18～24h均100%存活，菌落形態(tài)特征無明顯改，觸酶試驗(yàn)、膽汁溶菌試驗(yàn)均為陽性。在保存2年時(shí)生長稍欠佳，僅生長量減少，其他特征無明顯改變。淋球菌在保存1個(gè)月后經(jīng)2次用營養(yǎng)肉湯復(fù)蘇移種于血平皿及巧克力平皿經(jīng)35℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)18～24h均不生長，證明已死亡。

2.3 2011年3月保存2株菌株，分別是腦膜炎奈瑟菌和流感嗜血桿菌。到2011年9月經(jīng)1、3、6個(gè)月3個(gè)時(shí)間段用營養(yǎng)肉湯復(fù)蘇移種巧克力平皿上經(jīng)35℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)18～24h均100%存活，菌落形態(tài)特征無明顯改變且生長良好。

2.4 2009年3月保存3株標(biāo)準(zhǔn)菌株，分別是銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、大腸埃希菌（ATCC 25922）、肺炎克雷伯菌肺炎亞種（GY2000），經(jīng)1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年、2年5個(gè)時(shí)間段用營養(yǎng)肉湯復(fù)蘇移種血平皿上經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24h存活率均為100%，細(xì)菌的生長特性、形態(tài)染色特征無明顯變化，其中銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、大腸埃希菌（ATCC 25922）2株標(biāo)準(zhǔn)菌株在保存到1年（2010年10月31日）和2年（2011年11月25日）時(shí)用Phoein100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀，45項(xiàng)生化反應(yīng)2次檢測結(jié)果完全相同，說明2株標(biāo)準(zhǔn)菌株在保存2年后，其生化反應(yīng)特性沒有發(fā)生改變。藥敏試驗(yàn)2次試驗(yàn)結(jié)果也完全相同，結(jié)果見表1。

3 討 論

用濾紙法保存的22株非苛養(yǎng)菌及5株酵母樣真菌在保存2年后其存活率均為100%，菌落形態(tài)特征無明顯改變且生長良好?？琉B(yǎng)菌中肺炎鏈球菌在保存2年時(shí)均100%存活，血平皿上菌落形態(tài)特征無明顯改變，觸酶試驗(yàn)、膽汁溶菌試驗(yàn)均為陽性，在2年時(shí)生長稍欠佳，僅生長量減少，可能有部分菌種死亡，其他特征無明顯改變；腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌保存半年均100%存活，在巧克力平皿上菌落形態(tài)特征無明顯改且生長良好；淋球菌在保存1個(gè)月后就已經(jīng)死亡。對(duì)于苛養(yǎng)菌株，除對(duì)溫度比較敏感的淋球菌不能用該方法保存外，肺炎鏈球菌存活時(shí)間長，存活率較高，也比較適合用該方法保存；腦膜炎奈瑟菌和流感嗜血桿菌，在短時(shí)間內(nèi)存活較好，但長時(shí)間保存和對(duì)生物學(xué)特性的影響尚待進(jìn)一步研究。

標(biāo)準(zhǔn)菌株銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、大腸埃希菌（ATCC 25922）、肺炎克雷伯菌肺炎亞種（GY2000）用濾紙法保存近3年，存活率均為100%，菌落形態(tài)特征無明顯變化。銅綠假單孢菌（ATCC 27853）、大腸埃希菌（ATCC 25922）2株標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)Phoein100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀檢測，2年內(nèi)生物學(xué)特性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），藥物敏感性試驗(yàn)少部分檢測值與參照值不完全相符，但2次檢測值相同，說明該方法保存2株標(biāo)準(zhǔn)菌株2年內(nèi)是穩(wěn)定的，與參照值不符可能是實(shí)驗(yàn)前的菌株變異造成的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，濾紙保存法能滿足實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控非苛養(yǎng)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的保存要求，同時(shí)也適合基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室保存一些用于教學(xué)的普通非苛養(yǎng)菌株。此方法無需特殊設(shè)備，操作簡單，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。保存時(shí)間較長，有報(bào)道此法可保存銅綠假單胞菌5年甚至更長時(shí)間，并且菌種生物學(xué)特性穩(wěn)定，是一種適合于基層實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用的菌種保存方法。

[1] 劉英，王磊，吳紅艷，等.銅綠假單胞菌菌種濾紙保存法探討[J].中國病原生物學(xué)雜志，2009，4（9）：716－719.

[2] 葉晴，尹光琳.用真空冷凍干燥法保存微生物菌株[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器，2000，12（4）：19－20.

[3] 葉應(yīng)嫵，王毓三.全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M].2版.南京：東南大學(xué)出版社，1997：632.