核磷酸酶基因與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的研究＊

舒 婷綜述，姚 軍審校（臺(tái)州學(xué)院椒江校區(qū)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，浙江臺(tái)州 318000）

磷酸酶基因（PTEN）基因即與張力蛋白同源在10號(hào)染色體有缺失的PTEN具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等功能。由于該基因在人類多種腫瘤細(xì)胞中存在突變或缺失，因此它被認(rèn)為是繼p53基因之后發(fā)現(xiàn)的又一重要的抑癌基因[1]。在一些癌變組織中都有PTEN不同程度的突變或丟失，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、進(jìn)展期的前列腺癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、腎腫瘤、小細(xì)胞肺癌和皮膚黑色素瘤等[1]。PTEN的分布具有組織特異性，在皮膚、結(jié)腸、乳腺、前列腺等組織細(xì)胞中，PTEN主要分布于細(xì)胞質(zhì)中；在神經(jīng)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)、甲狀腺等組織細(xì)胞中，PTEN分布于細(xì)胞核中；在極化的MDCK犬腎細(xì)胞，PTEN位于細(xì)胞間的緊密連接處[2－3]。細(xì)胞質(zhì)PTEN具有負(fù)調(diào)控磷脂酰肌醇－3－羥基激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/AKT）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用[4]；但新近的研究表明，PTEN的核移位可能促成其腫瘤抑制活性[3]。

1 PTEN的結(jié)構(gòu)與功能

PTEN定位于10q23.3染色體，全長(zhǎng)200kb，包含9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子。其cDNA的5′端是由804個(gè)核苷酸組成的非編碼區(qū)，含多個(gè)CGG三核酸重復(fù)序列，為甲基化提供了基礎(chǔ)[1]。PTEN的高甲基化使基因處于靜止?fàn)顟B(tài)，導(dǎo)致PTEN低水平轉(zhuǎn)錄及PTEN蛋白的減少甚至缺失[1]。非編碼區(qū)后是開放閱讀框，由1 209個(gè)核苷酸組成，PTEN mRNA長(zhǎng)5.5kb，編碼403個(gè)氨基酸的蛋白產(chǎn)物。PTEN的第5外顯子十分重要，參與編碼PTEN蛋白磷酸酶核心基序[1]。

PTEN蛋白由N端的磷酸酶結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域及C端結(jié)構(gòu)域組成[5]。PTEN蛋白的C端尾部結(jié)構(gòu)域是一個(gè)由約50個(gè)氨基酸組成的，主要包括2個(gè)氨基酸單字母編碼（PEST）結(jié)構(gòu)域序列和一個(gè) PDZ（PSD－95/Dig/ZO1）同源結(jié)構(gòu)域結(jié)合序列[5]。PEST結(jié)構(gòu)域序列為一富含脯氨酸（P）、谷氨酰胺（E）、絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）等10個(gè)氨基酸組成的結(jié)構(gòu)序列[5]。PEST結(jié)構(gòu)域序列有助于蛋白折疊，若其缺失將導(dǎo)致PTEN的降解速度加快[5]。因此，PEST序列的存在對(duì)PTEN蛋白的穩(wěn)定性和細(xì)胞膜定位有一定作用，如果將其敲除，則可通過影響蛋白折疊導(dǎo)致PTEN表達(dá)下降[6]。PDZ同源結(jié)構(gòu)域結(jié)合序列位于C末端的第400～403位氨基酸，是蛋白質(zhì)間相互作用的結(jié)構(gòu)域[5]。其主要通過參與蛋白質(zhì)間的相互作用來增強(qiáng)PTEN磷酸酶活性和信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，即PTEN蛋白可通過PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合序列與其他含有PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合序列的蛋白相互作用而影響PTEN功能，也有維護(hù)PTEN蛋白穩(wěn)定性的作用[5]。

PTEN蛋白的N端有1段與細(xì)胞張力蛋白、輔助蛋白同源的序列，含有177個(gè)氨基酸，為主要的結(jié)構(gòu)功能區(qū)[7]。細(xì)胞張力蛋白是一種細(xì)胞骨架蛋白，而輔助蛋白與神經(jīng)突觸小泡的運(yùn)輸有關(guān)[7]。PEST同源結(jié)構(gòu)域有助于蛋白折疊，如果其缺失將導(dǎo)致PTEN迅速降解；PDZ結(jié)合基序的缺失不影響PTEN降解，不過它可與PDZ蛋白相互作用，可能有利于PTEN的定位以及與別的蛋白質(zhì)的相互作用[7]。PTEN通過PDZ結(jié)合基序與上皮細(xì)胞膜緊密連接上膜相關(guān)反向鳥苷酸激酶－2的PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合，來加強(qiáng)PTEN抑制 Akt活性[8]。由此可見PTEN的C端特殊區(qū)域在調(diào)節(jié)PTEN的穩(wěn)定性和酶活性方面非常重要，其突變可逆轉(zhuǎn)抑癌基因的表型，影響突變體的穩(wěn)定性和磷酸酶活性[8]。

2 PTEN的核轉(zhuǎn)位機(jī)制

PTEN如何進(jìn)入核內(nèi)是目前的研究熱點(diǎn)之一，有研究表明泛素化能調(diào)控PTEN的核輸入。Trotman等確認(rèn)Cowden綜合征家族患者PTEN的1個(gè)賴氨酸突變?yōu)楣劝彼幔↘289E），他們通過分析有這種生殖細(xì)胞突變患者的腸息肉，展示了K289E突變蛋白已從發(fā)育異常的上皮細(xì)胞核中除去，進(jìn)一步展示了超量表達(dá)的綠色熒光蛋白（GFP）－PTEN，K289E融合蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)，而野生型GFP－PTEN融合蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都存在[9]。PTEN的這種分布異常與其磷酸酶活性無關(guān)，而是由于細(xì)胞核輸入的極大降低（無細(xì)胞核輸出增加）導(dǎo)致的[9]。此外賴氨酸13被確認(rèn)是轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的第2個(gè)泛素化位點(diǎn)[9]。這個(gè)最初在散發(fā)腦腫瘤患者中發(fā)現(xiàn)的賴氨酸突變體K13E中斷了PTEN的核轉(zhuǎn)位，并減少了PTEN核輸入[9]?？梢奒289和K13這2個(gè)賴氨酸殘基作為泛素化位點(diǎn)，是PTEN穿梭和核輸入所必需的[9]。

泛素化是由一系列酶連續(xù)催化的反應(yīng)，研究表明核內(nèi)PTEN隨著泛素化的增加而劇烈增加，尤其是單泛素化[9－11]。PTEN受多泛素化影響而在胞漿內(nèi)儲(chǔ)留，并最終被蛋白酶體降解[9－11]。單泛素化的PTEN在核內(nèi)特異濃縮，這證實(shí)單泛素化的PTEN是最有效的穿梭模式，但具體機(jī)制尚不明確[9－11]?？赡苁怯捎趩畏核鼗ㄟ^某些機(jī)制增強(qiáng)了PTEN核輸入的信號(hào)，或者通過其他獨(dú)立的進(jìn)程所致。而且核定位的PTEN與染色體的穩(wěn)定性有關(guān)，神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)的進(jìn)行性下調(diào)基因（NEDD4－1）可通過泛素化調(diào)控 PTEN 入核和抑癌作用[9]。PTEN泛素化是通過NEDD4－1介導(dǎo)的，其生理過程非常復(fù)雜[10]。NEDD4－1是PTEN主要的E3泛素化連接酶，可以連同PTEN其他位點(diǎn)一起泛素化K289[11]。抑制NEDD4－1能使PTEN在胞漿內(nèi)重新分配，而NEDD4－1過度表達(dá)將增加PTEN的核轉(zhuǎn)位[11]。

單泛素化的PTEN富含于核碎片中，不是所有的核PTEN都能被單泛素化，這提示PTEN在細(xì)胞核中被泛素移除或者部分核PTEN沒有通過泛素化進(jìn)入核內(nèi)[11]。顯然，針對(duì)核中PTEN去泛素化酶的鑒定，可解釋另一調(diào)節(jié)PTEN穩(wěn)定和定位的規(guī)律。與此相反，單泛素化能介導(dǎo)PTEN進(jìn)入核內(nèi)并增加其穩(wěn)定性[9]，然而通過NEDD4－1介導(dǎo)的PTEN多泛素化會(huì)加強(qiáng)PTEN的降解[10]。雖然核內(nèi)的單泛素化PTEN濃縮增多，但PTEN并不都是通過單泛素化入核的，這表明PTEN在核內(nèi)有去泛素化，或者一部分PTEN沒有經(jīng)過泛素化入核，但這一機(jī)制尚不清楚[9－11]。

3 核PTEN的功能

核PTEN對(duì)細(xì)胞的許多生物學(xué)功能均有影響：（1）與p53形成的核內(nèi)復(fù)合體能抑制p53降解并增加p53的轉(zhuǎn)錄活性[12－13]；（2）可不依賴于抑制 Akt的活性來阻止細(xì)胞的增殖[14]；（3）可下調(diào)細(xì)胞周期蛋白 D1（Cyclin D1）水平并能阻止絲裂原活化蛋白激酶磷酸化[15]；（4）調(diào)控PIP結(jié)合受體類固醇生成因子－1和肝臟受體類似物的活性[16－17]；（5）外源性PTEN入核可增加細(xì)胞凋亡[3]；（6）參與維持染色體的穩(wěn)定性[3]。

4 核PTEN與腫瘤

核PTEN是怎樣抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展的呢？最近研究發(fā)現(xiàn)，PTEN可以通過單泛素化進(jìn)入細(xì)胞核，并通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和維持染色體完整性而起到腫瘤抑制的作用[18]。Shen等[18]發(fā)現(xiàn)阻止PTEN表達(dá)可造成染色體破碎片段增加，從而出現(xiàn)著絲粒和染色體易位。核PTEN有維持染色體穩(wěn)定和完整的功能，可能是通過與著絲粒特異結(jié)合蛋白－C的相互作用以維持染色體的穩(wěn)定性來促進(jìn)DNA修復(fù)家族Rad51轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的修復(fù)及減少DNA雙鏈的斷裂。因此，核PTEN可能和p53蛋白一樣，可以起到維持基因組穩(wěn)定的作用。

4.1 核PTEN與胃癌 胃癌是一種常見的惡性腫瘤，目前認(rèn)為胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)有序的、多階段、多步驟的過程，并且是多種因素的綜合結(jié)果，但主要是因?yàn)橐职┗虻氖Щ詈桶┗虻幕罨?。核PTEN表達(dá)下調(diào)的分子基礎(chǔ)是由基因突變、過度甲基化等構(gòu)成。Hino等[19]發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中核PTEN有較高的陰性表達(dá)率，并伴有mRNA及總蛋白水平降低。Wang等[20]也發(fā)現(xiàn)，60例進(jìn)展期胃癌中有17例（28.3%）存在核PTEN基因突變，其中包括8例錯(cuò)義突變、5例沉默突變、2例無義突變、1例堿基缺失和1例內(nèi)含子拼接供體位點(diǎn)突變。因此，核PTEN基因突變?cè)谶M(jìn)展期胃癌的發(fā)生中可能起重要作用。

Bai等[21]研究表明，核PTEN高表達(dá)的腫瘤患者預(yù)后顯著好于核PTEN低表達(dá)的患者，核PTEN和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，分化程度低的胃癌患者低表達(dá)核PTEN。核PTEN的表達(dá)還與Lauren′s分型有關(guān)，說明了核PTEN可能抑制胃癌的發(fā)生和發(fā)展，與既往在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的PTEN研究結(jié)果相一致[22]。因此，核PTEN可能作為胃癌分子分型的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

4.2 核PTEN與結(jié)腸癌 核PTEN在正常結(jié)腸黏膜組織的表達(dá)也顯著多于結(jié)腸癌組織，而且核PTEN的表達(dá)與結(jié)腸癌腫瘤的體積及血液轉(zhuǎn)移的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)[23]。有其他研究發(fā)現(xiàn)，核PTEN的表達(dá)在正常組織－腺瘤－腺癌－轉(zhuǎn)移這一序列中依次下降，提示核PTEN表達(dá)對(duì)于結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要，并發(fā)現(xiàn)核PTEN表達(dá)的缺失是Ⅱ期結(jié)腸癌患者預(yù)后不良的重要指標(biāo)之一[24]。

4.3 核PTEN與其他腫瘤 Gil等[25]研究發(fā)現(xiàn)PTEN磷酸化影響其核、質(zhì)定位。PTEN的第380位上的絲氨酸被丙氨酸取代和第383位上的蘇氨酸被丙氨酸取代突變體主要定位于細(xì)胞核中，由于該突變體不能發(fā)生磷酸化修飾，提示非磷酸化PTEN更傾向定位于細(xì)胞核。然而Chung等[26]用同樣的PTEN突變體在人乳腺癌MCF－7細(xì)胞中研究卻未發(fā)現(xiàn)突變對(duì)PTEN核、質(zhì)定位有影響。體外突變體實(shí)驗(yàn)得到的這些矛盾結(jié)果促使學(xué)者對(duì)內(nèi)源性PTEN磷酸化與其核、質(zhì)定位的關(guān)系進(jìn)行深入研究。有研究表明，細(xì)胞缺氧24h時(shí)，細(xì)胞核中PTEN蛋白含量明顯增高，而Westem blot結(jié)果顯示磷酸化的PTEN降低，總蛋白未見降低，即非磷酸化的PTEN蛋白增多，提示缺氧可降低PTEN磷酸化水平，促進(jìn)PTEN的核定位[27]，這與Gil等[25]發(fā)現(xiàn)的非磷酸化PTEN傾向定位于細(xì)胞核的現(xiàn)象一致。

在舌鱗癌組織中，PTEN蛋白的表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，PTEN的陽性率缺失表達(dá)可能參與舌鱗癌組織的分化過程。核PTEN通過拮抗低氧誘導(dǎo)因子－1α、基質(zhì)金屬蛋白酶－9，而在舌鱗癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲過程中發(fā)揮抑制作用[28]。在人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251MG細(xì)胞中，不需抑制Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，核內(nèi)的PTEN就能夠抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，促使細(xì)胞增殖停滯在G1期[14]。又有研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中53.1%的核PTEN呈陽性，而核PTEN蛋白的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小及分化程度均無相關(guān)性[29]。NEDD4－1并不是在所有情況中都具有致癌性，因?yàn)槠洳⒉荒芡耆齈TEN水平[11]。在大量浸潤(rùn)性膀胱癌標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)性膀胱癌與NEDD4－1的升高和PTEN蛋白減少存在一定聯(lián)系，但是在NEDD4－1和PTEN表達(dá)之間不存在持續(xù)性負(fù)相關(guān)，這可從NEDD4－1為調(diào)控PTEN穩(wěn)態(tài)水平的主要調(diào)節(jié)因子這一簡(jiǎn)易模型中預(yù)測(cè)到[11]。

5 結(jié)語及展望

盡管核PTEN及細(xì)胞質(zhì)PTEN均有腫瘤抑制功能，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，但是核PTEN的作用及其機(jī)制與細(xì)胞質(zhì)PTEN是不盡相同的。越來越多的證據(jù)表明，是否有多個(gè)PTEN的核輸入機(jī)制取決于細(xì)胞類型和細(xì)胞內(nèi)外微環(huán)境。核PTEN在調(diào)節(jié)細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡和穩(wěn)定中起強(qiáng)有力的作用，它有助于維持染色體的穩(wěn)定，促進(jìn)DNA修復(fù)和誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。針對(duì)核PTEN的研究將有助于深入探索PTEN與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系，還有助于在分子水平上揭示腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移機(jī)制，為篩選腫瘤標(biāo)志物、早期診斷和尋找有效治療方法打下基礎(chǔ)。

[1] Song MS，Salmena L，Pandolfi PP.The functions and regulation of the PTEN tumour suppressor[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2012，13（5）：283－296.

[2] Hamada K，Sasaki T，Koni PA，et al.The PTEN/PI3K pathway governs normal vascular development and tumor angiogenesis[J].Genes Dev，2005，19（17）：2054－2065.

[3] Planchon SM，Waite KA，Eng C.The nuclear affairs of PTEN[J].J Cell Sci，2008，121（Pt 3）：249－253.

[4] Martelli AM，Evangelisti C，Chappell W，et al.Targeting the translational apparatus to improve leukemia therapy：roles of the PI3K/PTEN/Akt/mTOR pathway[J].Leukemia，2011，25（7）：1064－1079.

[5] HlobilkováA，KnillováJ，Bártek J，et al.The mechanism of action of the tumour suppressor gene PTEN[J].Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub，2003，147（1）：19－25.

[6] Torres J，Rodriguez J，Myers MP，et al.Phosphorylationregulated cleavage of the tumor suppressor PTEN by caspase－3：implications for the control of protein stability and PTEN－protein interactions[J].Biol Chem，2003，278（33）：30652－30660.

[7] Rodríguez－Escudero I，Oliver MD，Andrés－Pons A，et al.A comprehensive functional analysis of PTEN mutations：implications in tumor－and autism－related syndromes[J].Hum Mol Genet，2011，20（21）：4132－4142.

[8] Tolkacheva T，Boddapati M，Sanfiz A，et al.Regulation of PTEN binding to MAGI－2by two putative phosphorylation sites at threonine 382and 383[J].Cancer Res，2001，61（13）：4985－4989.

[9] Trotman LC，Wang X，Alimonti A，et al.Ubiquitination regulates PTEN nuclear import and tumor suppression[J].Cell，2007，128（1）：141－156.

[10] Wang X，Trotman LC，Koppie T，et al.NEDD4－1is a proto－oncogenic ubiquitin ligase for PTEN[J].Cell，2007，128（1）：129－139.

[11] Baker SJ.PTEN enters the nuclear age[J].Cell，2007，128（1）：25－28.

[12] Freeman DJ，Li AG，Wei G，et al.PTEN tumor suppressor regulates p53protein levels and activity through phosphatase－dependent and－independent mechanisms[J].Cancer Cell，2003，3（2）：117－130.

[13] Su JD，Mayo LD，Donner DB，et al.PTEN and phosphatidylinositol 3′－kinase inhibitors up－regulate p53and block tumor－induced angiogenesis：evidence for an effect on the tumor and endothelial compartment[J].Cancer Res，2003，63（13）：3585－3592.

[14] Liu JL，Sheng X，Hortobagyi ZK，et al.Nuclear PTEN－mediated growth suppression is Independent of Akt down－regulation[J].Mol Cell Biol，2005，25（14）：6211－6224.

[15] Chung JH，Eng C.Nuclear－cytoplasmic partitioning of phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10（PTEN）differentially regulates the cell cycle and apoptosis[J].Cancer Res，2005，65（18）：8096－8100.

[16] Krylova IN，Sablin EP，Moore J，et al.Structural analyses reveal phosphatidyl inositols as ligands for the NR5orphan receptors SF－1and LRH－1[J].Cell，2005，120（3）：343－355.

[17] Ortlund EA，Lee Y，Solomon IH，et al.Modulation of human nuclear receptor LRH－1activity by phospholipids and SHP[J].Nat Struct Mol Biol，2005，12（4）：357－363.

[18] Shen WH，Balajee AS，Wang J，et al.Essential role for nuclear PTEN in maintaining chromosomal integrity[J].Cell，2007，128（1）：157－170.

[19] Hino R，Uozaki H，Murakami N，et al.Activation of DNA methyltransferase 1by EBV latent membrane protein 2A leads to promoter hypermethylation of PTEN gene in gastric carcinoma[J].Cancer Res，2009，69（7）：2766－2774.

[20] Wang JY，Huang TJ，Chen FM，et al.Mutation analysis of the putative tumor suppressor gene PTEN/MMAC1in advanced gastric carcinomas[J].Virchows Arch，2003，442（5）：437－443.

[21] Bai Z，Ye Y，Chen D，et al.Homeoprotein Cdx2and nuclear PTEN expression profiles are related to gastric Cancer prognosis[J].APMIS，2007，115（12）：1383－1390.

[22] Semba S，Satake S，Matsushita M，et al.Phosphatase activity of nuclear PTEN is required for CDX2－mediated intestinal differentiation of gastric carcinoma[J].Cancer Lett，2009，274（1）：143－150.

[23] Hsu CP，Kao TY，Chang WL，et al.Clinical significance of tumor suppressor PTEN in colorectal carcinoma[J].Eur J Surg Oncol，2011，37（2）：140－147.

[24] Jang KS，Song YS，Jang SH，et al.Clinicopathological significance of nuclear PTEN expression in colorectal adenocarcinoma[J].Histopathology，2010，56（2）：229－239.

[25] Gil A，Andrés－Pons A，F(xiàn)ernández E，et al.Nuclear localization of PTEN by a Ran－dependent mechanism enhances apoptosis：Involvement of an N－terminal nuclear localization domain and multiple nuclear exclusion motifs[J].Mol Biol Cell，2006，17（9）：4002－4013.

[26] Chung JH，Ginn－Pease ME，Eng C.Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10.（PTEN）has nuclear localization signal－like sequences for nuclear import mediated by major vault protein[J].Cancer Res，2005，65（10）：4108－4116.

[27] 周云英，劉華，郭銳翰，等.缺氧影響PTEN磷酸化和核定位[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，32（2）：244－248.

[28] 李善昌，劉芷君.HIF－1α、MMP－9及PTEN在舌鱗癌組織中的表達(dá)及意義[J].口腔醫(yī)學(xué)研究，2011，27（10）：896－898.

[29] Hu TH，Wang CC，Huang CC，et al.Down－regulation of tumor suppressor gene PTEN，overexpression of p53，plus high proliferating cell nuclear antigen index predict poor patient outcome of hepatocellular carcinoma after resection[J].Oncol Rep，2007，18（6）：1417－1426.