10例皮膚病患者應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病原真菌感染診斷與應(yīng)用

李寶坤

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng) 110847

在最近幾年，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，抑制免疫類(lèi)的藥物被廣泛的應(yīng)用。病原真菌感染的疾病在不斷增多，所以菌種在臨床診斷和治療中也是非常重要的。真菌感染的診斷，可以以形態(tài)學(xué)為主要依據(jù)，但這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且檢測(cè)率比較低。隨著目前迅速發(fā)展的生物學(xué)技術(shù)，病原真菌生物學(xué)的特性越研究越深，本文對(duì)生物學(xué)技術(shù)對(duì)病原真菌感染診斷進(jìn)行了分析和研究。隨著生命科學(xué)和滑雪的不斷發(fā)展，人們對(duì)生物體的研究進(jìn)入到更深的層次，從當(dāng)個(gè)的生物體發(fā)展到器官在到組織等。從細(xì)胞結(jié)果到核酸和蛋白的分子，到細(xì)胞結(jié)果到蛋白的分子水平，人們也逐漸認(rèn)識(shí)到可以通過(guò)檢測(cè)分子水平的線(xiàn)性結(jié)果來(lái)比較不同物種，或者同種物種不同個(gè)體之間的差異。這也為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的每個(gè)領(lǐng)域提供一個(gè)更好的研究平臺(tái)，一般分子生物學(xué)技術(shù)研究有以下幾種：PCR、分子克隆、核酸電泳、瓊脂糖凝膠電泳、測(cè)序DNA、RNA 提取、轉(zhuǎn)化外源DNA、體外轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄、cDNA文庫(kù)構(gòu)建、原位雜交、酵母雙雜交、差減雜交、扣除雜交，藍(lán)白斑篩選、抗生素篩選。

1 材料與方法

1.1 材料

真菌菌種，真菌菌種分為標(biāo)準(zhǔn)株與實(shí)驗(yàn)株，抽取念珠菌、煙曲霉菌，克柔念珠菌、新生銀球菌近視分離實(shí)驗(yàn)。細(xì)菌菌株：大腸埃希氏菌、銅綠假單細(xì)胞菌、黃金色葡萄球菌，實(shí)驗(yàn)株，金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌、腸球菌，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室對(duì)其標(biāo)本進(jìn)行分離鑒定。

培養(yǎng)基：SDA

緩沖液：抽取DNA緩沖液、電泳緩沖液、10%SDS、電泳點(diǎn)樣緩沖液。

分子量標(biāo)記： DNA/EcoRI+Hind（0.5pg/pl），由上海華美生物工程有限公司提供。

酶及PCR反應(yīng)體系

Taq DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將在人體內(nèi)抽取到的真菌基因進(jìn)行DNA制備：實(shí)驗(yàn)菌種接種與SDA器皿中，在28℃的溫度下培養(yǎng)一周，用牙簽刮去菌絲體，入到離心管中，進(jìn)行稱(chēng)重，DNA采用酚氯仿進(jìn)行純化，將DNA與溴酚藍(lán)緩沖液進(jìn)行混合，點(diǎn)樣與0.8%瓊脂凝膠。

菌株基因組的DNA引物PCR：模板的DNA準(zhǔn)備，提取DNA在分光光度儀的1000分廣度上測(cè)定波長(zhǎng)為260納米的OD值，以1XTE進(jìn)行稀釋。

引物準(zhǔn)備：對(duì)引物進(jìn)行準(zhǔn)備，1 0D+379ulddh2o稀釋至濃度為10uM。

PCR起始反應(yīng)：起始變性，溫度在94℃以上，5 min，變形溫度為94℃，1 min，退火47℃，1 min。延伸72℃，1 min，38個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。

PCR加樣順序，在0.5 mg的量管中，需要加入ddH2o，在加入PCR buffer、dNTP、引物、模板和聚合酶。在同一引物中，不同模板的PCR反應(yīng)是不同的，可以按照上述的加樣順序，按照一定比例加入到母管中，分裝入到不同的模板中。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行保存，產(chǎn)物可以暫存于4℃，若是需要存儲(chǔ)，在要冷凍與零下20℃。

電泳：配制1.2%的瓊脂糖凝膠，凝膠中繳入EB溶液，濃度達(dá)到要求。點(diǎn)樣：取一定量的PCR產(chǎn)物，與溴酚藍(lán)緩沖液緩和，加入點(diǎn)樣孔中，在紫外透射下照相。

2 結(jié)果

2.1 DNA抽取結(jié)果

在檢驗(yàn)的過(guò)程中，絲狀真菌DNA片頓大小都是在21KB以上，電泳凝膠上的溴酚藍(lán)沒(méi)有出現(xiàn)RNA模糊亮團(tuán)的情況。用DNA試劑盒法，以便能夠提取酵母菌中的DNA，觀察可發(fā)現(xiàn)大小均在21KB以上，呈帶狀，片段保存比較完整。

2.2 引物PCR的分析

在電泳凝膠上，可以觀察到衛(wèi)星引物和隨機(jī)引物，并且能夠很好的觀察到一些常見(jiàn)的皮膚菌類(lèi)，致病念珠菌，可以和常見(jiàn)的酵母菌區(qū)分開(kāi)來(lái)。在實(shí)驗(yàn)中不難發(fā)現(xiàn)，引物PCR的方法很穩(wěn)定，對(duì)于區(qū)別皮膚菌類(lèi)和非皮膚菌類(lèi)都有很好的效果，現(xiàn)實(shí)的條帶差別比較明顯和直觀。

3 討論

病原真菌感染是皮膚常見(jiàn)的多發(fā)病和常見(jiàn)癥。其中發(fā)病的位置都會(huì)在手癬、體癬、手足癬等一些淺表念珠菌病。真菌感染主要以皮膚癬菌和非皮膚癬菌為主。病原真菌的發(fā)病范圍比較廣，復(fù)發(fā)率也比較高。根據(jù)調(diào)查，在2011年和2012年中華醫(yī)學(xué)會(huì)的皮膚病調(diào)查顯示，在皮膚科門(mén)診的患者中，足癬發(fā)病率高達(dá)45%和42%，甲真菌病的發(fā)病率達(dá)到15%，就個(gè)人來(lái)講，病原真菌在很大程度上影響患者的生活質(zhì)量。目前對(duì)于病原真菌的治療有很多治療方法，有很多新的廣譜藥物，都有不同抗菌譜。有些皮膚使用新的藥物來(lái)控制癬菌，但有的藥物控制的副作用比較大，會(huì)出現(xiàn)不同的抑菌濃度。

最近幾年，人類(lèi)真菌感染的發(fā)生率也在不斷上升，而這些問(wèn)題也會(huì)引起很多醫(yī)學(xué)研究者的注意。傳統(tǒng)對(duì)真菌分子生物學(xué)檢測(cè)的方法是形狀學(xué)檢測(cè)和分離培養(yǎng)等步驟，傳統(tǒng)的方法費(fèi)用較高，浪費(fèi)大量的時(shí)間，敏感度低，而且特異性也比較低。PCR是一種真菌分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，主要用于方法特定某個(gè)部分的DNA片段。PCR方法的問(wèn)世，也使得分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)得到了迅速的發(fā)展。PCR的體外酶促方法，也可以擴(kuò)增位于兩端的序列DNA。而對(duì)于PCR的改進(jìn)技術(shù)，需要針對(duì)敏感性和特異性來(lái)操作。PCR的方法已經(jīng)滲透到各個(gè)領(lǐng)域中，并且應(yīng)用于真菌的治療中。根據(jù)真菌的序列設(shè)計(jì)通用引物，使用PCR的方法擴(kuò)增來(lái)判定感染真菌的種類(lèi)和特異性的引物。有的會(huì)選用靶基因，并且亞基序列比較保守，應(yīng)用于真菌通用引物比較方便，比較成熟的引物有NS1、NS3等等。有的研究學(xué)者表明，采用熒光標(biāo)記引物擴(kuò)增特異性ITS，結(jié)果能夠證明，獲得血液和組織的致病性在真菌種水平上的區(qū)分效果。也有研究者用多重PCR測(cè)定法來(lái)進(jìn)行鑒定口腔念珠菌，采用CA4、ITS1等等進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)過(guò)檢測(cè)，所有的菌種檢測(cè)都要比培養(yǎng)法準(zhǔn)確得多，也就說(shuō)多重PCR也是一種快速的檢測(cè)方法。

對(duì)于傳統(tǒng)的分子生物技術(shù)檢測(cè)的方法比較復(fù)雜，觀察容易出現(xiàn)誤差、分型粗糙、因變異所導(dǎo)致出現(xiàn)重復(fù)性差的缺點(diǎn)，所以對(duì)分子水平進(jìn)行分類(lèi)檢測(cè)也是必須的。病原真菌感染在傳統(tǒng)的分類(lèi)中，主要依靠體內(nèi)的培養(yǎng)形態(tài)和生理生化特征和免疫學(xué)等方法。這種方法也比較繁瑣，并且主觀性強(qiáng)、周期長(zhǎng)、重復(fù)性，并且也受到環(huán)境因素的影響，在分類(lèi)能力和穩(wěn)定性上受到一定的限制。按照一定的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)DNA的雜交檢測(cè)測(cè)定染色體序列。從基因的分型中顯示其優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)。而最近發(fā)展起來(lái)的，脈沖電場(chǎng)凝膠電泳的技術(shù)，已經(jīng)被充分應(yīng)用在生物基因的分析和鑒定。

[1] 曹玫，陶翠，房俊，等.油樟葉油枯提取物抗病原真菌活性研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012（11）：2792-2793．

[2] 郭敏.植物病原真菌學(xué)實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)方法的改革與探索[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（33）：16465-16466．

[3] 張超，廖萬(wàn)清.基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在病原真菌檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)真菌學(xué)雜志，2012（5）.