血栓形成及抗組織因子藥物研究進展

唐 寧 (南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 南京 211171)

血栓是指在機體血液中，由于血小板聚集或血液凝固等在心血管內(nèi)形成的固體。無論是動脈血栓還是靜脈血栓，都能引起肺栓塞、心肌梗死或缺血性中風(fēng)。生理性止血功能過度激活或動脈粥樣硬化斑塊破裂均易導(dǎo)致形成血栓。

1 機體凝血過程及血栓形成

正常情況下，小血管受損后引起的出血，在幾分鐘內(nèi)就會自行停止，這種現(xiàn)象稱為生理性止血。生理性止血是機體重要的保護機制之一。生理性止血過程主要包括血管收縮、血小板血栓的形成和血液凝固三個過程。首先血管收縮使局部血流減少。然后血小板黏附于受損的內(nèi)皮下組織，黏附后的血小板受到刺激釋放其顆粒中的腺苷二磷酸(ADP)、5-羥色胺、纖維蛋白原、凝血酶敏感蛋白等，除此以外也能釋放臨時合成的物質(zhì)，如血栓烷A2，引發(fā)血小板聚集，形成血小板止血栓，從而將傷口堵塞，達到初步止血;受損的血管也可啟動凝血系統(tǒng)，通過內(nèi)源性凝血途徑和外源性凝血途徑啟動機體凝血過程。內(nèi)源性凝血途徑是指參與凝血的因子全部來自血液，通常因血液與帶負電的異物表面接觸而啟動。外源性凝血途徑由來自于血液之外的組織因子(TF)暴露于血而啟動的凝血過程。兩途徑都能形成凝血酶原酶復(fù)合物，激活凝血酶原使之形成凝血酶，后者又可使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，最終形成血栓。臨床研究發(fā)現(xiàn)，先天性缺凝血因子的患者，幾乎沒有出血癥狀，表明這些凝血因子并不是機體生理性止血機制所必需的，也即這些因子在機體生理性凝血的啟動中不起重要的作用。目前認為，外源性凝血途徑在機體生理性凝血反應(yīng)的啟動中起關(guān)鍵性作用，組織因子是生理性凝血反應(yīng)過程的啟動物，而內(nèi)源性途徑對凝血反應(yīng)開始后的維持和鞏固起非常重要的作用。如果機體內(nèi)凝血機制過度激活，則容易導(dǎo)致血栓的形成。

2 TF的結(jié)構(gòu)與功能

TF是一種跨膜糖蛋白，存在于大多數(shù)組織細胞。生理情況下，直接與循環(huán)血液接觸的血細胞和內(nèi)皮細胞不表達組織因子。當血管受損時，暴露出TF，與血漿中的凝血因子結(jié)合，形成凝血酶原酶復(fù)合物。許多刺激因素如促炎癥因子、內(nèi)毒素、氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、黏附分子、切應(yīng)力等都能誘導(dǎo)細胞表達 TF〔1〕。

TF是一種由263個氨基酸組成的單一多肽鏈，分子量為46 kD。TF的結(jié)構(gòu)分為3部分：1～219位氨基酸構(gòu)成胞外區(qū)，第49與57及186與209位半胱氨酸分別形成2個二硫鍵，該區(qū)含有4個可與FⅦ結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基。220～242位氨基酸構(gòu)成跨膜區(qū)，為一疏水結(jié)構(gòu)，與膜磷脂緊密結(jié)合。243～263位氨基酸殘基構(gòu)成胞內(nèi)區(qū)，含3個有功能活性的絲氨酸殘基，為蛋白激酶C的作用底物〔2〕。

TF可在平滑肌細胞、纖維細胞、單核細胞、淋巴細胞、粒細胞、血小板和內(nèi)皮細胞中表達。組織損傷后，這些細胞入血，并快速激活凝血途徑。暴露于血液中的組織因子，與FⅦ結(jié)合，后者迅速轉(zhuǎn)變?yōu)镕Ⅶa，稱為FⅦa-組織因子復(fù)合物，該復(fù)合物在Ca2+和磷脂存在時迅速激活FⅩ，生成FⅩa。在此過程中組織因子是輔因子，它能使FⅦa催化FⅩ激活的效力增加1000倍。生成的FⅩa又能反過來激活FⅦ，進而可使更多的FⅩ激活，形成外源性凝血途徑的正反饋效應(yīng)。此外，F(xiàn)Ⅶa-組織因子復(fù)合物在Ca2+的參與下還能激活FⅨ，生成FⅨa。FⅨa除能與FⅦa結(jié)合而激活FⅩ外，也能反饋激活FⅦ。FⅦa-組織因子復(fù)合物的形成，使內(nèi)源性凝血途徑和外源性凝血途徑相互聯(lián)系，共同完成凝血過程〔3〕。值得指出的是，在病理狀態(tài)下，細菌內(nèi)毒免疫復(fù)合物、腫瘤壞死因子等均可襲擊血管內(nèi)皮細胞和單核細胞表達組織因子，從而啟動凝血過程，引起彌散性血管內(nèi)凝血〔4〕。如果抑制凝血連鎖反應(yīng)的最后一步則會導(dǎo)致出血的并發(fā)癥〔5〕，因此可以將啟動凝血過程的TF/FⅦ作為靶點來進行抗血栓的治療〔6〕。

3 抗TF藥物

3.1 TF途徑抑制物(TFPI)TFPI是機體內(nèi)源性組織因子抑制劑，有兩種異形體，即TFPI-1和TFPI-2，二者均有拮抗TF，抑制血栓形成的作用。TFPI-1和TFPI-2均屬于絲氨酸蛋白酶抑制物Kunitz家族成員〔7〕。TFPI通過Kunitz結(jié)構(gòu)域與TF及FⅦ結(jié)合，形成TFPI/TF/FⅦ復(fù)合物，負反饋調(diào)節(jié)凝血途徑，起到抑制血栓形成的作用〔8〕。除此以外，TFPI還能通過抗炎和抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊，預(yù)防冠心病的發(fā)生。目前，人們已經(jīng)可以通過基因工程的方法獲得大量重組的人源性TFPI，為臨床應(yīng)用開辟了廣闊的空間。

3.2 抑制TF活性的天然化合物 從天然化合物中尋找TF抑制劑及其先導(dǎo)化合物對于抗血栓藥物的發(fā)現(xiàn)具有深遠意義。Lee等〔7〕以凝血酶原時間(PT)為檢驗指標，從木瓜果實的乙酸乙酯提取物中發(fā)現(xiàn)了5個對TF有抑制作用的黃酮類化合物。黃酮類化合物存在于水果、蔬菜、茶葉、紅酒、種子、中藥及香料等多種植物和食物中〔8〕。流行病學(xué)和實驗證實多食用富含黃酮類的食物可以降低心血管系統(tǒng)發(fā)病風(fēng)險〔9〕。許多黃酮類化合物能夠抵抗炎癥，改善內(nèi)皮功能，抑制血小板聚集〔10～12〕。Jiang等〔13〕合成篩選出12個具有代表性的黃酮類化合物，在脂多糖誘導(dǎo)的單核細胞中檢驗了其抑制TF的活性，探討了這些黃酮類化合物結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系，其中有8個化合物的抑制作用呈劑量依賴型。

已發(fā)現(xiàn)的對TF有抑制作用的天然化合物大多具有活血化瘀或心血管保護作用，還有報道稱活血化瘀中藥復(fù)方補陽還五湯〔14〕對TF的表達也有抑制作用，其規(guī)律還有待進一步研究。

3.3 化學(xué)合成類抗組織因子藥物 Yang等〔15〕將研究小組合成的硫代磷酸寡核苷酸與熒光結(jié)合尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，通過原位雜交、免疫組化等方法發(fā)現(xiàn)硫代磷酸寡核苷酸能明顯的抑制動脈血管狹窄模型中TF的表達，提示這種反義核苷酸藥物具有應(yīng)用前景。

在很長一段時間內(nèi)香豆素類是唯一一個口服有活性的抗凝血藥物。本類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與維生素K類似，抑制了依賴維生素K的凝血因子的γ-羧化作用，從而影響凝血過程〔16〕。香豆素類抗凝作用持久，吸收后幾乎全部與血漿蛋白結(jié)合，與其他血漿蛋白結(jié)合率高的藥物同用時，可增加香豆素的游離藥物濃度，使其抗凝作用增強，甚至誘發(fā)出血〔17〕。Groebke等〔18〕合成了高活性、高選擇性的TF/FⅦ抑制劑，通過口服給藥途徑進入豚鼠體內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)其抗血栓效應(yīng)稱劑量依賴型，并且不會延長出血時間。PHA2927和pyridinone37等有抑制TF/FⅦ活性的作用〔19〕，他汀類藥物可降低 TF 活性〔20〕，常規(guī)抗血小板藥，如阿司匹林、波利維等亦可通過抑制TF表達〔21〕，抑制冠狀動脈血栓形成。

3.4 抗TF藥物的靶向治療 由于TF首先與FⅦ作用啟動了外源性凝血機制，所以許多研究表明抑制TF與FⅦ的結(jié)合可以有效地抑制血栓的形成，而且這種方式比起其他經(jīng)典的抗血栓治療能明顯地減少出血傾向〔22，23〕。凝血因子FⅦ輕鏈的N末端開始于含有一個Gla的區(qū)域，緊隨其后是兩個內(nèi)皮生長因子樣的區(qū)域，表皮生長因子(EGF)1和EGF2〔24〕。最近的研究表明EGF1在和組織因子的結(jié)合中起著重要作用〔25，26〕。因此Mei等〔27，28〕將 EGFP-EGF1 融合蛋白與納米顆粒(NP)相結(jié)合，形成EGFP-EGF1-NP藥物運載體，并且在這種球粒中嵌合了熒光染料。體外培養(yǎng)大鼠主動脈內(nèi)皮細胞，通過熒光顯微技術(shù)和流式細胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFP-EGF1-NP能特異性的結(jié)合到TF細胞的表面，對血栓有高特異性和高靈敏度。說明EGFP-EGF1-NP是一種很有前途的鐵蛋白靶向藥物溶栓治療傳送系統(tǒng)。該研究還表明這種新型的藥物運載體系的細胞毒性很低，具有較好的生物相容性。

4 展望

TF在凝血及血栓形成中的作用已經(jīng)明確，以TF為靶點的抗血栓藥物治療具有切實的臨床意義。隨著分子生物學(xué)與基因工程的發(fā)展與應(yīng)用，安全、高效的組織因子抑制劑將研制成功并應(yīng)用于臨床，在抗血栓方面發(fā)揮積極的作用，帶來極大地社會效益和經(jīng)濟效益。

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