TACE激酶在豬排卵過(guò)程中的作用機(jī)制

王亞磊，茆達(dá)干

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京 210095）

腦垂體分泌的促黃體素（LH）可以刺激排卵前卵泡，誘導(dǎo)排卵過(guò)程：包括卵泡壁的破裂，顆粒細(xì)胞黃體化，卵丘擴(kuò)展以及卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的成熟。LH 受體主要在顆粒細(xì)胞中表達(dá)，顆粒細(xì)胞黃體化水平過(guò)高時(shí)受體即降解，因此，可能需要其它潛在因子與顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞或卵母細(xì)胞互作誘導(dǎo)排卵過(guò)程的進(jìn)行。Conti 等通過(guò)研究PMSG 與hCG 刺激的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞mRNA表達(dá)圖譜，發(fā)現(xiàn)hCG 作用后的EGF 樣因子、雙調(diào)蛋白(AREG)、表皮調(diào)節(jié)素（EREG）和β-動(dòng)物纖維素(BTC)表達(dá)量明顯升高，應(yīng)用這些因子體外培養(yǎng)能加強(qiáng)卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展以及小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的成熟。EGF 樣因子作用于EGFR，激活顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中的Ras-MAPK1/3 通路，而含該通路下游基因Erk1/2 突變的干擾卵母細(xì)胞的成熟、卵丘的擴(kuò)展和顆粒細(xì)胞黃體化則會(huì)受到抑制，因此，EGF 樣因子可能是顆粒細(xì)胞自分泌的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素之一，使LH 依賴的顆粒細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)向卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞。EGF 樣因子是含有一個(gè)信號(hào)序列、一個(gè)跨膜區(qū)域和至少一個(gè)EGF 區(qū)域的跨膜蛋白。金屬蛋白酶作用于EGF 區(qū)域，使EGF 樣因子作為配基激活同源受體。腫瘤壞死因子α-轉(zhuǎn)運(yùn)酶（TACE），又稱為ADAM17，是ADAM 蛋白酶家族成員之一。Sahin等證明TACE 是小鼠胚胎細(xì)胞AREG和EREG 主要蛋白脫落物。TACE 在心臟、大腦、肺、肝臟、肌肉、腎臟和睪丸中均有表達(dá)。EGF 樣因子在排卵過(guò)程中的表達(dá)機(jī)制已被報(bào)道，但這些因子如何被特異性激活為配基，尤其是關(guān)于TACE/ADAM17的表達(dá)和功能還未見報(bào)道。本文介紹了TACE/ADAM17的表達(dá)和激活機(jī)制以及在豬卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞內(nèi)的生理功能。

1 TACE/ADAM17在豬顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中的表 達(dá)

TACE/ADAM17屬于去整合素和金屬蛋白酶（A Disintegrin And Metalloproteinase,ADAM）蛋白家族成員，該家族包含30 多種蛋白質(zhì)，其中約50%主要在睪丸中表達(dá)，調(diào)控精子發(fā)生過(guò)程，其他成員主要在神經(jīng)發(fā)生、肌生成、骨生成和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。與其他ADAM 蛋白家族不同，TACE/ADAM17mRNA 主要在免疫組織中表達(dá)，在癌細(xì)胞中高量表達(dá)，參與激活EGFR-MAPK3 通路從而引起癌細(xì)胞增殖和遷移。排卵過(guò)程中EGF 樣因子的表達(dá)可以短暫顯著地激活顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中EGFR-MAPK3/1 通路。因此可推測(cè)在排卵過(guò)程中TACE/ADAM17可能作為EGF 樣因子的脫落酶在顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中表達(dá)。

應(yīng)用eCG/hCG 預(yù)處理的豬有腔卵泡、排卵前卵泡和接近排卵的卵泡中顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞TACE/ADAM17mRNA 表達(dá)出現(xiàn)短暫變化。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，單獨(dú)應(yīng)用eCG 來(lái)誘導(dǎo)卵泡發(fā)育到排卵前階段，顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中TACE/ADAM17mRNA 的表達(dá)水平并沒有增加，然而再由hCG 刺激時(shí)mRNA 表達(dá)顯著增加。

為了闡明TACE/ADAM17如何在排卵過(guò)程中的表達(dá)，應(yīng)用體外顆粒細(xì)胞和卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)FSH 和/或LH 處理可以增加這2 種細(xì)胞TACE/ADAM17mRNA 的表達(dá)水平，從而導(dǎo)致Areg 和Ereg mRNA 的表達(dá)量增加。Western Blotting 結(jié)果表明COCs 的卵丘細(xì)胞內(nèi)FSH 和LH 誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)量亦有增加。研究還發(fā)現(xiàn)，TACE/ADAM17的表達(dá)量可被PKA、p38MAPK 或MAPK3/1 通路的抑制劑抑制。TACE鄰近的啟動(dòng)子包括大量的AP2 和Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并且包含一個(gè)GC框 和 一 個(gè)CCAAT 框（MAPK3/1 的靶位點(diǎn)）。C/EBPα 和C/EBPβ 可以直接結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)域的CCAAT 框，但是它們亦可被PKA 和p38MAPK 通路激活。小鼠的顆粒細(xì)胞LH 刺激可迅速激活PKA 和p38MAPK 通路，然后EGF 樣因子的表達(dá)誘導(dǎo)MAPK3/1的磷酸化。因此，PKA 和p38MAPK激活的TACE/ADAM17表達(dá)可以釋放EGF 樣因子的EGF 區(qū)域，進(jìn)而增加MAPK3/1 的磷酸化水平。MAPK3/1-C/EBP 通路可以進(jìn)一步增加TACE/ADAM17的表達(dá)水平從而維持信號(hào)通路的激活狀態(tài)。

2 TACE/ADAM17在豬顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中的功能

已經(jīng)報(bào)道的TACE/ADAM17在許多組織和細(xì)胞類型中的可能基質(zhì)包括轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子α（TGFα），肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子（HB-EGF），Notch，Areg 和Ereg。 小 鼠 卵 巢TGFα 和HB-EGF 低量表達(dá)，并且在卵泡發(fā)育和排卵過(guò)程中表達(dá)量沒有變化，表明這些因子不是TACE/ADAM17的潛在靶蛋白。Johnson 等報(bào)道了生長(zhǎng)卵泡中作用于PMSG 的Notch mRNA，但Notch 在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的作用未被證實(shí)。

在排卵過(guò)程中Areg 和Ereg 在顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中表達(dá)，它們隨著TACE/ADAM17mRNA 的表達(dá)水平增加而誘導(dǎo)，表明Areg 和Ereg 可能是接近排卵卵泡中TACE/ADAM17的生理基質(zhì)。應(yīng)用促性腺激素培養(yǎng)豬COCs 40 h 能 增 強(qiáng)TACE/ADAM17酶的活性。EGF 或促性腺激素誘導(dǎo)COCs 的卵丘細(xì)胞中MAPK3/1 的磷酸化。TACE/ADAM17的選擇抑制劑TAPI-2 降 低FSH 和LH 誘 導(dǎo) 的 豬COCs 或顆粒細(xì)胞MAPK3/1 的磷酸化水平。然而，在EGF 樣因子誘導(dǎo)培養(yǎng)的COCs 或顆粒細(xì)胞中這些抑制效應(yīng)就不存在。此外，在大鼠的顆粒細(xì)胞，LH 誘導(dǎo)的MAPK3/1 的磷酸化可被TACE/ADAM17干 擾RNA 的 轉(zhuǎn) 染 所抑制。因此，在顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中TACE/ADAM17的表達(dá)可能促進(jìn)EGF樣因子EGF 區(qū)域的釋放，從而激活在排卵過(guò)程中的顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中EGFR-MAPK3/1 通路。

3 豬COCs的卵丘細(xì)胞中EGF樣因子、TACE/ADAM17 和PGE2的正反饋調(diào)節(jié)

排卵前卵泡的卵泡液中含有大量的前列腺素E2（PGE2）。敲除Ptgs2（編碼環(huán)氧化酶2，COX-2）或Pger2（編碼PGE2 受體2，PGER2）的小鼠表現(xiàn)為卵母細(xì)胞排出數(shù)量減少，受精能力降低。先前的研究表明Ptgs2 敲除的小鼠在施加hCG 過(guò)程中EGF 樣因子的表達(dá)量減少，而EGF 樣因子又會(huì)使Ptgs2的表達(dá)量增加，表明在排卵過(guò)程中EGF樣因子與PGE2 之間存在正反饋系統(tǒng)。

對(duì)豬的COCs 進(jìn)行體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)， 由FSH 誘 導(dǎo)Ptgs2 和Ptger2 的表達(dá)進(jìn)而引起Areg、Ereg 和TACE/ADAM17的表達(dá)。利用PTGS2 的抑制劑NS398 培養(yǎng)COCs 10 h，顯著降低卵丘細(xì)胞中Areg，Ereg 和TACE/ADAM17的表達(dá)量，但是培養(yǎng)5 h 的細(xì)胞沒有變化。豬的COCs 體外培養(yǎng)成熟過(guò)程中，cAMP 水平5 h 內(nèi)顯著增高，一直持續(xù)到40 h。然而，單獨(dú)用FSH培養(yǎng)的COCs 的卵丘細(xì)胞中，編碼FSH 受體的Fshr 基因表達(dá)水平顯著性降低，這表明增加卵丘細(xì)胞中cAMP 水平的其他刺激物是由卵丘細(xì)胞分泌的。通過(guò)NS398 培養(yǎng)5 h 時(shí)cAMP 水平?jīng)]有發(fā)生變化，而培養(yǎng)10 h 就會(huì)明顯降低，且顯著抑制MAPK3/1 通路。在豬和小鼠中，單獨(dú)添加PGE2 會(huì)誘導(dǎo)卵丘擴(kuò)展，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的成熟，表明PGE2 是作用于卵丘細(xì)胞維持cAMP水平的第二因子。結(jié)果表明EGF 樣因子和TACE/ADAM17的最初表達(dá)是促性腺激素依賴性的，然而EGF 樣因子和TACE/ADAM17的持續(xù)表達(dá)依賴于PGE2-PGER2 通路。

4 豬COCs的卵丘細(xì)胞中PGR通路調(diào)控TACE/ADAM17的末端表達(dá)

敲除Nr3c3 基因（編碼孕酮受體，PGR）的小鼠不能排卵，然而這些小鼠卵巢的組織學(xué)分析表明注射hCG 后卵丘會(huì)正常擴(kuò)展。另一方面，豬的COCs體外培養(yǎng)成熟過(guò)程中PGR 的藥理抑制物或孕酮產(chǎn)物會(huì)顯著抑制卵丘的擴(kuò)展和卵母細(xì)胞的成熟。另外，單個(gè)COC 培養(yǎng)時(shí)，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的起始階段相對(duì)于20 個(gè)COCs 一起培養(yǎng)時(shí)明顯會(huì)被推遲。介質(zhì)中孕酮的含量隨每孔COCs數(shù)的增加而增加，表明孕酮-PGR 通路至少會(huì)影響體外培養(yǎng)的豬COCs 中卵丘的擴(kuò)展和卵母細(xì)胞的成熟。

為了確定孕酮-PGR 通路的作用， 進(jìn) 一 步 對(duì)EGFR-MAPK3/1 通路進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)，添加PGR 的抗性劑RU486 不影響FSH 誘導(dǎo)的Areg和Ereg 在任何培養(yǎng)階段的表達(dá)，也不會(huì)影響培養(yǎng)20 h 的COCs 的卵丘細(xì)胞 中TACE/ADAM17mRNA 的 表達(dá)，但會(huì)明顯抑制培養(yǎng)30 h 和40 h 的TACE/ADAM17mRNA 的表達(dá)，培養(yǎng)40 h 時(shí)MAPK3/1 的磷酸化水平以及靶基因（Fas2 和Tnfaip6）的表達(dá)被顯著性抑制。此外，卵丘的擴(kuò)展和達(dá)到減數(shù)分裂MII 階段的卵母細(xì)胞百分率也會(huì)被RU486 抑制。這些結(jié)果表明，孕酮-PGR 通路在卵丘擴(kuò)展過(guò)程后期調(diào)節(jié)TACE/ADAM17的表達(dá)，但不影響EGF 樣因子水平，這對(duì)豬的卵丘擴(kuò)展和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過(guò)程中EGF 樣因子的末端分泌是很重要的。然而，由于TACE/ADAM17基因的啟動(dòng)子區(qū)域并不包含孕酮應(yīng)答元素（PRE），因此，孕酮-PGR 通路怎樣調(diào)節(jié)末端的TACE/ADAM17基因表達(dá)需要進(jìn)一步研究。

5 結(jié)論

EGF 樣因子是促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟和排卵的重要因子。通過(guò)TACE/ADAM17釋放EGF 樣因子的EGF 區(qū)域?qū)е翬GFR-MAPK3/1 通路的激活，從而誘導(dǎo)豬的COCs 中卵丘的擴(kuò)展和卵母細(xì)胞的成熟。

略)