補(bǔ)體C3a、類胰蛋白酶與羊水栓塞關(guān)系的研究＊

李 偉，余 艦，龍艷麗，趙 敏，張國棟

（1.湖北省咸寧市第一人民醫(yī)院病理科 437000；2.貴州省遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院法醫(yī)鑒定中心 563003；3.貴州省遵義醫(yī)學(xué)院法醫(yī)系 563003；4.廣西桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院 541000）

羊水栓塞（amniotic fluid embolism，AFE）是產(chǎn)科發(fā)生率低卻兇險(xiǎn)的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重威脅母嬰安全［1］，且AFE的病死率并未隨著醫(yī)療的進(jìn)步而有所降低［2］。羊水及其有形成分進(jìn)入母體循環(huán)后如何導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)一系列病理生理變化，迄今為止依然不十分清楚。Benson等［3］認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制可能是無抗體參加的過敏樣反應(yīng)，羊水進(jìn)入母體后激發(fā)內(nèi)源性介質(zhì)的釋放，建議將AFE稱之為“妊娠過敏樣綜合征”，與此相關(guān)的介質(zhì)有補(bǔ)體C3a、類胰蛋白酶等［4］。本課題以28例尸檢病例為研究對象，采用免疫組織化學(xué)法來檢測補(bǔ)體C3a、類胰蛋白酶等在肺組織中的表達(dá)，從免疫介導(dǎo)的過敏角度初步研究與探討AFE可能的發(fā)病機(jī)制，試圖為AFE的診斷提供一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究的標(biāo)本均來自遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科及遵義醫(yī)院。選取近10年產(chǎn)科尸檢病例28例，臨床高度懷疑尸檢明確診斷為AFE病例4例（AFF組）；臨床診斷為產(chǎn)后出血而尸檢及蘇木素－伊紅（HE）染色未發(fā)現(xiàn)羊水有形成分的病例16例，包括HE染色高度可疑AFE病例（PHH組）；其他8例（陰性對照組）死因分別為：妊娠期高血壓疾病、麻醉意外、晚孕疤痕子宮破裂、妊娠期外傷等。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)試劑 補(bǔ)體C3a（北京博奧森公司），TPS（美國DAKO公司），熒光顯色劑，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑，磷酸鹽緩沖液（PBS），山羊血清封閉液（北京中衫金橋公司）。

1.2.2 方法及結(jié)果判定 所有標(biāo)本均以10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。連續(xù)石蠟切片，厚約4μm。取肺組織切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，免疫組織化學(xué)標(biāo)記及熒光標(biāo)記。標(biāo)記抗原為補(bǔ)體C3a、TPS。免疫組織化學(xué)采用Envision法，DAB顯色。組織抗原修復(fù)采用高壓與微波修復(fù)處理。補(bǔ)體C3a稀釋濃度為1∶50，TPS稀釋濃度為1∶100。結(jié)果判定以肺小動脈或者肺毛細(xì)血管內(nèi)或血管周圍出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結(jié)果。棕黃色顆粒少或顏色淡為弱陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，運(yùn)用四表格法的確切概率（FISH法）計(jì)算，以P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

尸檢明確診斷為AFE的4例病例（AFE組），其HE染色的肺組織切片中，小血管以及毛細(xì)血管內(nèi)看到成團(tuán)或絲狀的鱗狀上皮（圖1）。

AFE組TPS陽性表達(dá)4例，陽性表達(dá)為棕黃色顆粒呈光環(huán)圍繞肥大細(xì)胞周圍，見圖2，陰性對照組肺組織和AFE組中補(bǔ)體C3a表達(dá)情況見圖3、4，TPS熒光陽性表達(dá)則在肺組織毛細(xì)血管內(nèi)可見綠色熒光斑，見圖5；PHH組TPS陽性表達(dá)9例；陰性對照組TPS弱陽性表達(dá)1例；AFE組、PHH組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 AFE病例肺小動脈內(nèi)羊水有形成分（HE×40）

圖2 肺組織中肥大細(xì)胞脫顆粒TPS表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)×400）

圖3 陰性對照組肺組織中補(bǔ)體C3a表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)×100）

圖4 AFE組補(bǔ)體C3a情況（免疫組織化學(xué)×100）

AFE組補(bǔ)體C3a表達(dá)較對照組均降低，陰性對照組中補(bǔ)體C3a表達(dá)情況，可見多量棕黃色顆粒，呈陽性表達(dá)（圖3）；圖4AFE組中補(bǔ)體C3a情況，與圖3比較棕黃色顆粒明顯減少，呈弱陽性表達(dá)；PHH組部分補(bǔ)體C3a表達(dá)較對照組亦降低，弱陽性表達(dá)7例；陰性對照組補(bǔ)體C3a8例均陽性表達(dá)；AFE組、PHH組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 肺泡壁毛細(xì)血管TPS熒光表達(dá)（免疫熒光×200）

3 討 論

AFE雖發(fā)生率低但母嬰死亡率高，易引起醫(yī)療糾紛需要法醫(yī)學(xué)鑒定［5］。目前尚無統(tǒng)一、明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)，因此不少患者可能被誤診，一些輕癥及不典型患者會因一過性表現(xiàn)而漏診，貽誤最佳治療時(shí)機(jī)。

傳統(tǒng)診斷無法解釋補(bǔ)體活化及類胰蛋白酶釋放現(xiàn)象［6］，近年研究發(fā)現(xiàn)AFE在血流動力學(xué)及血液學(xué)上與過敏性休克極為相似［7］。多數(shù)學(xué)者在研究AFE病例時(shí)，僅僅評估其類胰蛋白酶水平，從肥大細(xì)胞脫顆粒角度探討其與過敏反應(yīng)的關(guān)系，并沒有同時(shí)檢測補(bǔ)體水平變化［8］。值得一提的是，在補(bǔ)體參與經(jīng)典的抗原抗體介導(dǎo)的過敏反應(yīng)中，可引起肥大細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)［9］。補(bǔ)體活化可直接、間接導(dǎo)致機(jī)體自身組織損傷，可能是肺循環(huán)功能障礙的主要原因，故補(bǔ)體活化可能是AFE的始動環(huán)節(jié)［8］。本研究中AFE組補(bǔ)體C3a表達(dá)與陰性對照組比較，大幅度的降低，而陰性對照組的病例之間的補(bǔ)體水平表達(dá)沒有明顯改變，說明了在AFE過程中可能存在補(bǔ)體活化；產(chǎn)后出血病例中，7例補(bǔ)體C3a表達(dá)呈弱陽性，說明此部分的產(chǎn)后出血病例中，可能也存在補(bǔ)體活化。目前關(guān)于補(bǔ)體在AFE中作用機(jī)制的研究尚少，本課題的回顧性研究對補(bǔ)體C3a與AFE的關(guān)系不能做最終定論。其在AFE中的確切分子生物學(xué)機(jī)制仍待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，AFE病例HE染色均能觀察到羊水有形成分，在支氣管壁、肺泡毛細(xì)血管檢測到類胰蛋白酶，呈衛(wèi)星現(xiàn)象包繞肥大細(xì)胞，免疫熒光陽性［10］，表明肥大細(xì)胞發(fā)生脫顆粒反應(yīng)，提示在AFE的過程中可能存在過敏反應(yīng)。本研究16例產(chǎn)后出血（包括2例疑似AFE），類胰蛋白酶陽性表達(dá)9例，表明此部分產(chǎn)后出血也可能存在過敏反應(yīng)。國外報(bào)道，超過50%的AFE尸檢病例，并無AFE典型臨床表現(xiàn)［11］，僅為大量產(chǎn)后出血［12］。本研究中的9例產(chǎn)后出血是否與AFE有直接關(guān)系，尚不能確定，還有待更進(jìn)一步的研究。

對AFE患者或是可疑AFE患者可嘗試同時(shí)檢測補(bǔ)體C3a、類胰蛋白酶的含量，為臨床早期治療、預(yù)防嚴(yán)重并發(fā)癥、緩解緊張的醫(yī)患關(guān)系及為法醫(yī)學(xué)鑒定診斷提供一個(gè)較準(zhǔn)確的依據(jù)，也為AFE的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

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