蛇肽保健酒對(duì)小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的影響＊

曹娟娟，和七一，趙瑛，張榮春，魏世蓉，鄒家麗，鄧可宣 ，余曉東

（重慶市動(dòng)物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／重慶市生物活性物質(zhì)工程研究中心／重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 400047）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性全身性自身免疫性疾病，病理基礎(chǔ)為關(guān)節(jié)滑膜炎，公認(rèn)的RA發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DCS）介導(dǎo)自身反應(yīng)性T細(xì)胞的異常活化［1］。因臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，加上類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）特異性較差，在其他自身免疫性疾病甚至正常人血清中都檢測(cè)得到，最終因不能及時(shí)治療而致關(guān)節(jié)功能障礙，致殘率較高，嚴(yán)重危害了人類的身體健康［2－4］。中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為毒蛇及其毒性成分有祛風(fēng)解毒、鎮(zhèn)痙止痛的功效，能治療風(fēng)濕痛、四肢麻木、半身不遂等癥［5］。本實(shí)驗(yàn)室研制開(kāi)發(fā)的蛇肽保健酒，肽濃度18mg／100mL，乙醇濃度為35%，具有提高機(jī)體免疫能力、增強(qiáng)機(jī)體性功能、延緩衰老和抗疲勞等功效［6］。佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjunctive arthritis，AA）小鼠是目前廣泛應(yīng)用的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型之一。該模型以多發(fā)性關(guān)節(jié)炎為特征，原發(fā)病變主要是局部急性炎癥反應(yīng)，并于致炎后一段時(shí)間出現(xiàn)繼發(fā)病變，同時(shí)出現(xiàn)以細(xì)胞免疫變化為主的免疫功能紊亂［7］。本研究以AA小鼠為模型，研究蛇肽保健酒對(duì)AA小鼠足趾和踝關(guān)節(jié)腫脹度、體質(zhì)量、脾臟指數(shù)以及血清循環(huán)免疫復(fù)合物（CIC）水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 昆明種健康雄性成年小鼠60只，體質(zhì)量（20±2）g；蛇肽保健酒，酒基，弗氏完全佐劑（FCA），地塞米松片，硼酸緩沖液，聚乙二醇；濃縮儀，電子游標(biāo)卡尺，電子分析天平，酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥方式 將60只小鼠隨機(jī)分為6組，即對(duì)照組、模型組、酒基組、蛇肽低劑量組和高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只。除對(duì)照組注射生理鹽水外，在其他各組小鼠右后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑（FCA）0.02mL誘導(dǎo)炎癥發(fā)生。造模成功后第2天至34d，開(kāi)始對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，每只小鼠每天1次，每次0.2mL。陽(yáng)性對(duì)照組以1mg／kg地塞米松進(jìn)行灌胃，酒基組按10mL／kg灌胃，蛇肽保健酒組分別按8.3mL／kg（低劑量）、33.2mL／kg（高劑量）灌胃，對(duì)照組和模型組用純凈水對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃。

1.2.2 AA小鼠足趾和踝關(guān)節(jié)腫脹度的測(cè)定 在造模后第2、10、18、26、34天用電子游標(biāo)卡尺測(cè)定各組小鼠右后肢足趾和踝關(guān)節(jié)直徑。

1.2.3 小鼠體質(zhì)量和脾臟指數(shù)的測(cè)定 在造模后第2、10、18、26、34天分別稱量小鼠體質(zhì)量。于末次給藥24h后，稱量體質(zhì)量。之后脫頸處死小鼠，剖解剝離脾臟，稱取脾臟質(zhì)量，以脾臟質(zhì)量比小鼠的質(zhì)量作為脾臟指數(shù)。

1.2.4 CIC的測(cè)定 造模后第34天，小鼠眼球取血，離心（3000r／min，10min）分離血清，血清用2倍體積0.1mol／L硼酸緩沖液（pH＝8.4）稀釋備用。測(cè)定管與對(duì)照管各加稀釋血清30μL，測(cè)定管加入4.1%聚乙二醇溶液300μL，對(duì)照管加入上述硼酸緩沖液300μL，混勻后4℃放置1h。用酶標(biāo)儀以495nm波長(zhǎng)測(cè)定各管吸光度（A）值，檢測(cè)結(jié)果表示為測(cè)定管A495nm－對(duì)照管A495nm。

表1 蛇肽酒對(duì)AA小鼠右后足趾腫脹度的影響（mm，，n＝10）

表1 蛇肽酒對(duì)AA小鼠右后足趾腫脹度的影響（mm，，n＝10）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與模型組比較；c：P＜0.01，與對(duì)照組比較。

組別 第1天 第2天 第10天 第18天 第26天 第34天對(duì)照組 2.29±0.02 2.29±0.02 2.16±0.04 2.36±0.04 2.44±0.07 2.45±0.01模型組 2.33±0.02 3.65±0.17c 3.33±0.10c 3.77±0.07c 3.60±0.24c 3.54±0.08c酒基組 2.32±0.04 3.67±0.14c 3.27±0.10c 3.64±0.06c 3.42±0.11c 3.43±0.07c蛇肽低劑量組 2.30±0.06 3.50±0.07c 3.28±0.07c 3.63±0.09c 3.12±0.09bc 2.92±0.06bc蛇肽高劑量組 2.30±0.06 3.62±0.14c 3.16±0.08c 3.77±0.06c 3.43±0.10c 3.35±0.10c陽(yáng)性對(duì)照組 2.29±0.09 3.76±0.07c 3.14±0.09c 3.40±0.18ac 3.09±0.15ac 3.18±0.08ac

表2 蛇肽酒對(duì)AA小鼠右后踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響（mm，，n＝10）

表2 蛇肽酒對(duì)AA小鼠右后踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響（mm，，n＝10）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與模型組比較；c：P＜0.01，與對(duì)照組比較。

組別 第1天 第2天 第10天 第18天 第26天 第34天對(duì)照組 3.41±0.09 3.35±0.10 3.26±0.03 3.51±0.08 3.35±0.02 3.29±0.08模型組 3.35±0.04 4.24±0.10c 4.12±0.12c 4.43±0.09c 4.21±0.10c 4.25±0.07c酒基組 3.52±0.05 4.31±0.08c 3.95±0.10c 4.38±0.09c 3.92±0.09a 3.88±0.10b蛇肽低劑量組 3.43±0.07 4.32±0.07c 4.04±0.07c 4.43±0.10c 3.97±0.06a 3.82±0.08b蛇肽高劑量組 3.51±0.05 4.26±0.03c 3.90±0.06c 4.32±0.06c 4.02±0.06a 4.00±0.07a陽(yáng)性對(duì)照組 3.50±0.05 4.40±0.05c 3.96±0.11c 4.07±0.11a 3.93±0.03a 3.90±0.12a

表3 蛇肽酒對(duì)AA小鼠體重的影響（g，，n＝10）

表3 蛇肽酒對(duì)AA小鼠體重的影響（g，，n＝10）

a：P＜0.05，與陽(yáng)性對(duì)照組比較。

組別 第1天 第2天 第10天 第18天 第26天 第34天對(duì)照組 18.92±0.59 20.79±0.63 27.93±1.16 32.98±0.97 36.55±1.18 37.62±1.20模型組 19.00±0.30 20.43±0.43 27.34±0.73 32.44±1.71 34.74±2.04 35.93±2.31酒基組 20.08±0.35 21.40±0.31 26.22±0.88 31.99±1.36 35.56±1.21 36.81±1.11蛇肽低劑量組 19.50±0.70 20.86±0.39 26.74±1.27 34.21±1.56 38.16±1.61a 39.80±1.83a蛇肽高劑量組 19.33±0.49 20.82±0.47 25.82±1.04 32.50±0.97 36.27±1.04 37.68±1.38陽(yáng)性對(duì)照組 19.42±0.47 21.00±0.56 26.23±0.99 28.95±1.93 33.68±1.43 33.33±0.67

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蛇肽保健酒對(duì)AA小鼠右后足趾腫脹度的影響 由表1可見(jiàn)，從造模后第2天開(kāi)始，其他各組小鼠后足趾腫脹度顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。與模型組比較，從給藥后第17天即造模后第18天開(kāi)始，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠足趾腫脹明顯降低（P＜0.05）；從造模后第26天開(kāi)始，蛇肽低劑量組小鼠足趾腫脹度顯著降低（P＜0.01）；酒基組與蛇肽高劑量組均無(wú)顯著變化。

2.2 蛇肽保健酒對(duì)AA小鼠右后踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響 由表2可見(jiàn)，從造模后第2天開(kāi)始，其他各組小鼠右后踝關(guān)節(jié)腫脹度顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。在造模后第18天，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度顯著降低（P＜0.05）；造模后第26天，蛇肽低劑量組、蛇肽高劑量組、酒基組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度均顯著降低（P＜0.05）；造模后第34天，陽(yáng)性對(duì)照組、蛇肽高劑量組小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度均顯著降低（P＜0.05），蛇肽低劑量組和酒基組小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 蛇肽保健酒對(duì)AA小鼠體質(zhì)量的影響 由表3可見(jiàn)，從造模第18天開(kāi)始，與對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組體質(zhì)量增加緩慢，但未呈現(xiàn)顯著性差異；但蛇肽低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），第26天和第34天時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組與蛇肽低劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 蛇肽保健酒對(duì)AA小鼠脾臟指數(shù)的影響 造模后第34天，測(cè)定各組小鼠脾臟指數(shù)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組（2.90±0.22）比較，模型組小鼠的脾臟指數(shù)（4.49±0.08）升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組（4.49±0.08）小鼠相比，陽(yáng)性對(duì)照組（3.10±0.76）的脾臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；酒基組（2.35±0.10）、蛇肽低劑量組（2.60±0.19）和蛇肽高劑量組（3.03±0.35）的脾臟指數(shù)均降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.5 蛇肽保健酒對(duì)AA小鼠血清CIC水平的影響 造模后第34天，測(cè)定各組小鼠血清CIC指數(shù)，結(jié)果顯示模型組（2.38±1.22）小鼠血清CIC指數(shù)顯著高于對(duì)照組（0.52±0.10）（P＜0.05）；與模型組相比，蛇肽低劑量組（0.65±0.14）和陽(yáng)性對(duì)照組（0.37±0.09）的小鼠血清CIC指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。

3 討 論

3.1 蛇肽保健酒對(duì)AA小鼠踝關(guān)節(jié)和右后足趾腫脹度的影響 有研究發(fā)現(xiàn)眼鏡蛇毒素低、中、高劑量（2、10、50μg／kg）對(duì)大鼠右足踝關(guān)節(jié)腫脹均無(wú)顯著的抑制作用［8］。然而本研究發(fā)現(xiàn)：在足趾腫脹方面，陽(yáng)性對(duì)照組效果顯著，蛇肽低劑量組效果極顯著。在踝關(guān)節(jié)腫脹方面，陽(yáng)性對(duì)照組有顯著抑制效果，但蛇肽低劑量組效果極顯著，效果強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組。從而說(shuō)明蛇肽保健酒可明顯減輕關(guān)節(jié)炎外在癥狀，可出現(xiàn)受累關(guān)節(jié)腫脹減輕，防止組織局部組織損傷，對(duì)關(guān)節(jié)損傷有修復(fù)效應(yīng)［9］。但同時(shí)，酒基組小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度也有顯著性降低。分析其原因：乙醇可以通過(guò)增強(qiáng)先天免疫系統(tǒng)細(xì)胞的功能來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，無(wú)論是人或是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，低濃度乙醇均可能提高其免疫功能［10－13］，從而進(jìn)一步減輕踝關(guān)節(jié)腫脹。研究結(jié)果提示：地塞米松起效快，但蛇肽保健酒效果更為明顯，且蛇肽含量對(duì)抑制腫脹影響較大。

3.2 蛇肽保健酒對(duì)AA小鼠體質(zhì)量的影響 與對(duì)照組相比較，模型組與陽(yáng)性對(duì)照組小鼠體質(zhì)量均有下降趨勢(shì)，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照組小鼠不活躍，毛色暗淡，可見(jiàn)地塞米松在治療關(guān)節(jié)炎的同時(shí)對(duì)機(jī)體也造成了一定的損傷，不良反應(yīng)較大。

3.3 蛇肽保健酒對(duì)AA小鼠脾臟指數(shù)的影響 脾臟作為體內(nèi)最大的淋巴器官，具有儲(chǔ)血、調(diào)節(jié)血量和參與免疫等重要功能。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病例的一個(gè)特征就是脾臟腫大［14］。蛇肽高、低劑量組小鼠脾臟腫大均顯著減輕，效果與地塞米松組相當(dāng)。同時(shí)酒基對(duì)降低脾臟腫脹也有效果，且與蛇肽低、高劑量組結(jié)果相似。

3.4 蛇肽保健酒對(duì)AA小鼠CIC的影響 CIC是RA的一個(gè)重要檢測(cè)指標(biāo)［9］。本研究發(fā)現(xiàn)：僅蛇肽低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組小鼠CIC顯著降低，并恢復(fù)為正常水平。提示蛇肽酒與地塞米松均對(duì)調(diào)節(jié)AA小鼠體液免疫發(fā)揮作用。

綜合以上5個(gè)測(cè)量指標(biāo)，低劑量蛇肽酒與地塞米松均對(duì)AA小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎具有顯著的治療效果，但低劑量蛇肽酒治療效果更好，且未見(jiàn)不良反應(yīng)。蛇肽酒對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎的最佳治療劑量及其他功效有待于進(jìn)一步深入研究。

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