重組人C反應(yīng)蛋白在甲醇酵母中的分泌表達(dá)及鑒定＊

李軍明，林 衡，張立超，葛高順，胡學(xué)軍△

（大連大學(xué)：1.醫(yī)學(xué)院；2.生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連 116622）

C反應(yīng)蛋白（C－reactive protein，CRP）是目前發(fā)現(xiàn)的重要急性時(shí)相反應(yīng)蛋白之一。其作為靈敏的炎癥指標(biāo)、良好的心血管疾病發(fā)病診斷及其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測指標(biāo)，對(duì)于許多疾病的篩查、監(jiān)測以及療效評(píng)估具有重要價(jià)值［1－3］。目前商品化的CRP及其檢測試劑多依賴進(jìn)口，價(jià)格昂貴，阻礙了其臨床研究與應(yīng)用［4］。因此，本研究旨在探索利用真核甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)并制備具有免疫反應(yīng)性的重組人C－反應(yīng)蛋白（recombinant human C－reactive protein，rhCRP），為進(jìn)一步的rhCRP基礎(chǔ)研究及CRP檢測試劑的自主研制提供重要的實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自大連TaKaRa公司；Zeocin抗生素、HisTrap HP純化柱、羊抗鼠IgG－HRP抗體均為Invitrogen公司產(chǎn)品；抗 His－Tag－HRP單克隆抗體、小鼠抗人 CRP單克隆抗體、3，3′，5，5′－四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色液均購自Sigma公司，其它試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.1.2 菌株和載體 畢赤酵母X－33、表達(dá)載體pPICZαA均為本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌（E.coli）JM109購自大連TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pPICZαA／rhCRP的構(gòu)建 參照GenBank中檢索到的編碼人CRP的基因序列及表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)rhCRP基因并委托GenScript公司進(jìn)行人工合成后，經(jīng)XhoⅠ、XbaⅠ雙酶切并插入到載體pPICZαA中后轉(zhuǎn)化至E.coli JM109；通過含Zeocin（25μg／mL）的LS－LB平板篩選陽性克隆，接種并提取重組質(zhì)粒pPICZαA／rhCRP，然后進(jìn)行雙酶切鑒定及測序鑒定。

1.2.2 重組質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化及篩選 將SacⅠ線性化的pPICZαA／rhCRP及空載體pPICZαA各10μg，分別加入到80μL新制備的酵母感受態(tài)細(xì)胞中，通過電轉(zhuǎn)化的方式，將它們分別轉(zhuǎn)化入酵母 X－33中，于含Zeocin（100μg／mL）的 YPDS平板上、30℃溫箱中培養(yǎng)2～3d并將長出的單個(gè)菌落于含Zeocin（100μg／mL）的新鮮YPDS平板上再次篩選。

1.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定 將篩出的7個(gè)單克隆及陰性對(duì)照分別接種到含10mL BMGY培養(yǎng)基的50mL離心管中開始表達(dá)，方法參照Invitrogen公司提供的酵母表達(dá)手冊(cè)；經(jīng)濃度為0.5%的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)120h后，收集樣品并取上清進(jìn)行 Western blotting鑒定分析。然后，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。表達(dá)120h并收集全部上清后經(jīng)0.02mol／L磷酸鹽緩沖液透析，用HisTrap HP柱純化rhCRP。采用SDS－PAGE、Western blotting及Gel DocTM EZ凝膠成像系統(tǒng)檢測分析表達(dá)純化產(chǎn)物。

1.2.4 重組蛋白的免疫反應(yīng)性及穩(wěn)定性鑒定 純化蛋白通過間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測其免疫反應(yīng)性。將純化的rhCRP稀釋到適當(dāng)濃度后，各取100μL稀釋液包被酶標(biāo)板，同時(shí)做空白對(duì)照；采用1∶6000稀釋的鼠抗人CRP單克隆抗體作一抗，1∶5000稀釋的羊抗鼠IgG－HRP抗體作二抗；用TMB顯色后測定其吸光度值。將純化的rhCRP樣品保存于4℃冰箱4、8周后，分別重復(fù)上述的間接ELISA檢測。每次檢測各重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行比較分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pPICZαA／rhCRP的構(gòu)建 重組質(zhì)粒pPICZαA／rhCRP經(jīng)XhoⅠ、XbaⅠ雙酶切鑒定，可見約為681 bp的目的條帶和3491bp的載體條帶，片段大小與預(yù)期一致，見圖1；其測序結(jié)果經(jīng)Vector NTI、Sequencher軟件分析顯示與設(shè)計(jì)的基因序列完全一致，表明重組表達(dá)載體構(gòu)建正確。見圖1。

圖1 重組質(zhì)粒pPICZαA／rhCRP的酶切鑒定

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 篩選的7個(gè)單克隆酵母菌株，經(jīng)0.5%的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)120h后，取培養(yǎng)液上清進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果顯示，其中3個(gè)單克隆在相對(duì)分子質(zhì)質(zhì)量約23×103處出現(xiàn)明顯特異性條帶，且大小與預(yù)期結(jié)果一致，而空載體酵母株未顯現(xiàn)出目的條帶，見圖2。

2.3 重組蛋白的分離純化及鑒定 純化的蛋白經(jīng)SDS－PAGE檢測分析顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量為23×103處成功分離出單一的蛋白條帶，相對(duì)分子質(zhì)量符合預(yù)期大小且蛋白的洗脫峰集中在2～7管的300mmol／L咪唑洗脫液中，見圖3；純化蛋白經(jīng)Western blotting檢測證實(shí)為目的蛋白，見圖4；經(jīng)Gel DocTM EZ凝膠成像系統(tǒng)檢測分析表明，一步純化即獲得純度達(dá)90.42%的rhCRP。

圖2 目的蛋白rhCRP的誘導(dǎo)表達(dá)

圖3 純化重組蛋白的SDS－PAGE分析

圖4 純化重組蛋白的Western blotting分析

圖5 重組蛋白的免疫反應(yīng)性及穩(wěn)定性鑒定分析

2.4 重組蛋白的免疫反應(yīng)性及穩(wěn)定性鑒定 經(jīng)間接ELISA法將新制備的及于4℃保存4、8周后的rhCRP樣品進(jìn)行其免疫反應(yīng)性和穩(wěn)定性的鑒定。結(jié)果顯示，其吸光度A450平均值分別為0.9621、0.9588和0.9589，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

3 討 論

傳統(tǒng)獲得人CRP的方法主要是從患者血清或腹水中直接分離純化得到。由于人血清或腹水成分復(fù)雜，故純化時(shí)難度大、操作復(fù)雜，而且材料來源困難，產(chǎn)量低［4－5］。隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展，通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)醫(yī)用蛋白是當(dāng)今生物及醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。目前，國內(nèi)外利用基因工程的方法獲得重組人CRP的研究已有報(bào)道［6－9］，但都存在一定的弊端，本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步探究更經(jīng)濟(jì)、更高效的制備rhCRP的途徑。

本研究選用了近年來發(fā)展非常迅速的一個(gè)真核表達(dá)系統(tǒng)－甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)外源蛋白具有眾多優(yōu)勢［10］。酵母為簡單的單細(xì)胞真核生物，既具有原核細(xì)胞的生長快，可進(jìn)行細(xì)胞高密度培養(yǎng)的特點(diǎn)，又具有類似真核細(xì)胞的翻譯后加工修飾功能［11］；既避免了大腸桿菌細(xì)胞［8］表達(dá)rhCRP時(shí)易形成包涵體、純化復(fù)雜等問題，又比哺乳動(dòng)物細(xì)胞［7］和昆蟲細(xì)胞［6］生產(chǎn)rhCRP的成本低；而且該系統(tǒng)可分泌表達(dá)目的蛋白，易于目的蛋白的分離純化［10－11］。

本研究利用真核甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)，成功構(gòu)建了rhCRP的畢赤甲醇酵母表達(dá)菌株，在強(qiáng)啟動(dòng)子AOX1的調(diào)控下，成功分泌表達(dá)了rhCRP；經(jīng)一步分離純化即分離出純度較高的rh－CRP，并經(jīng)間接ELISA檢測證實(shí)其具有良好的免疫反應(yīng)性和穩(wěn)定性，為下一步rhCRP的優(yōu)化表達(dá)研究、抗人CRP抗體制備以及人CRP檢測試劑的自主研發(fā)，提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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