前B細胞克隆增強因子在體外循環(huán)術后肺血管內皮通透性增加中的機制研究＊

曾 源，楊 威，張小強，李 斌，董 嘯

（南昌大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院心胸外科，江西南昌 330006）

前B細胞克隆增強因子（PBEF）是一種具有調控炎癥、糖脂代謝、氧化應激和細胞凋亡等多種作用的分子，并參與內皮血管形成、心臟保護效應、炎癥和免疫應答等［1－2］。PBEF通過抑制中性粒細胞凋亡、介導炎癥因子產生、調控肺血管上皮細胞和內皮細胞的通透性等途徑在急性肺損傷中起到非常重要的作用［3－4］。本研究建立大鼠模型以分析PBEF在體外循環(huán)（CPB）術后肺血管內皮通透性增加中的機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物模型和分組 動物模型由南昌大學心血管病研究所提供，成熟雄性昆明種小鼠，體質量250～300g。進行動物分組，每組10組，對照組：大鼠只進行麻醉、CPB插管，不行CPB轉流；A組：大鼠行慢病毒AD－PBEFshRNA轉染；B組：大鼠進行30min深低溫停循環(huán)；C組：大鼠行慢病毒AD－PBEF－shRNA轉染后，再進行30min深低溫停循環(huán)。

1.2 方法

1.2.1 組織標本采集 大鼠處死后取右肺前葉用于肺組織濕干重比的測定，右肺中后葉固定于4%甲醛溶液中，乙醇脫水，石蠟包埋，切片成4μm厚。組織脫蠟后，用蘇木精和伊紅染色供病理觀察。取左肺等分置于兩個凍存管中，放入－80℃液氮中急凍保存，留待 Western blotting和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測。

1.2.2 Western blotting和ELISA檢測 Western blotting檢測：取出－80℃保存左肺組織，提取細胞總蛋白，電泳轉膜，進行一抗和二抗結合反應，避光室溫振搖孵育1h，洗膜，熒光系統(tǒng)掃描，以β－actin作為內參照，計算機記錄每個條帶的灰度積分值，以樣品積分值／內參照積分值比值進行統(tǒng)計學分析。檢測包括PBEF表達，磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE－cadherin、磷酸化FAK表達。ELISA檢測：取大鼠外周血標本5mL，3000r／min離心10min，取上清液儲于－80℃冰箱保存。取出血清并稀釋，再用濃縮洗滌液稀釋，加入底物顯示液，在酶標板上與單抗結合，在相應的波長處測各孔吸光度（A）值，求平均值。檢測包括MMP2／9和VEGF表達水平。

表1 PBEF、P38MAPK、ERK、MLC、VE－cadherin和FAK表達結果（，n＝10）

表1 PBEF、P38MAPK、ERK、MLC、VE－cadherin和FAK表達結果（，n＝10）

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，與C組比較。

組別9±0.03 1.12±0.05 A組 2.32±0.68ab 2.83±0.72ab 3.05±0.66ab 2.61±0.63ab 2.32±0.71ab 2.91±0.69ab B組 2.13±0.83ab 2.51±0.81ab 2.86±0.73ab 2.33±0.91ab 2.11±0.69ab 2.65±0.75ab C組 4.15±0.92a 4.35±0.95a 4.51±0.88a 3.92±0.83a 4.03±0.86a 4.62±0.84 PBEF P38MAPK ERK MLC VE－cadherin FAK對照組 1.11±0.08 1.13±0.05 1.08±0.03 1.12±0.06 1.0 a

1.2.3 肺組織濕干重比（W／D） 右肺前葉肺組織稱濕重后，置入70℃烤箱內，烘烤24h至恒重，稱干重，計算W／D比值。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料以表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 PBEF、P38MAPK、ERK、MLC、VE－cadherin和FAK表達結果 A、B組的PBEF、磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE－cadherin、磷酸化FAK表達與對照組和C組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；C組的PBEF、磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化 MLC、磷酸化 VE－cadherin、磷酸化FAK表達與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 VEGF、MMP2、MMP9和 W／D表達結果 A、B組的MMP2、MMP9與對照組和C組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；A組的VEGF、W／D與對照組和C組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；B組的VEGF、W／D與C組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 VEGF、MMP2、MMP9和 W／D表達結果（，n＝10）

表2 VEGF、MMP2、MMP9和 W／D表達結果（，n＝10）

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，與C組比較。

組別 VEGF（pg／mL）MMP2（ng／mL）MMP9（ng／mL） W／D 71.03±3.515.12±0.132.88±0.083.21±0.42 A組 92.51±5.83ab 6.49±0.11ab 3.87±0.11ab 4.62±0.41ab B組 88.79±5.61b 6.28±0.23ab 4.01±0.09ab 4.13±0.36b C組 110.37±10.52a7.36±0.28a4.96±0.16a5.95±0.52對照組a

2.3 病理結構改變 病理結果顯示，光鏡下對照組大鼠肺組織結構清晰，無中性粒細胞浸潤，肺泡壁薄。C組可見嚴重肺組織病理損害，肺損傷程度重，肺間質高度充血，大量中性粒細胞浸潤，小支氣管和小靜脈上皮細胞脫落，大部分肺泡間顯著增寬，肺泡腔部分萎縮，部分融合成肺大泡，腔內有紅細胞，形成微血栓，而且會隨著時間的延長逐漸加重。A、B組較C組有不同程度的減輕，A組的程度是最低的。

3 討 論

CPB技術是開展心臟外科心內直視手術的必備條件，但是CPB帶來的CPB術后肺功能障礙是人們不得不面對的一個難題［5－7］。肺缺血再灌注損傷的發(fā)生以及全身炎癥反應是目前公認的主要的CPB術后肺損傷發(fā)生機制。研究CPB術后肺損傷的分子機制有利于開發(fā)新的治療策略和新的防治藥物，減少CPB術后肺功能障礙的發(fā)生。

PBEF是B細胞早期分化的一種生長因子，具有促進前B細胞向B細胞轉化的能力。研究表明炎癥細胞因子會促進細胞內PBEF的表達，應用RNAi技術抑制PBEF表達能夠完全消除炎癥細胞因子對中性粒細胞的抗凋亡作用［8－9］。報道指出在急性肺損傷動物模型的血清、肺組織及支氣管肺泡灌洗液中PBEF的基因表達明顯增加［10］。通過降低PBEF蛋白表達可以減少內皮細胞的跨膜電阻，減少肌球蛋白輕鏈磷酸化和形成肌動蛋白，減少鈣離子的流動，從而改善凝血酶刺激造成的內皮細胞屏障功能障礙，減少急性肺功能損傷的發(fā)病率。PBEF過表達會延長炎癥反應時間，增加肺泡上皮細胞核肺血管內皮細胞的通透性，釋放炎癥因子引發(fā)肺損傷。李潔［11］研究發(fā)現(xiàn)重癥急性胰腺炎發(fā)生相關肺損傷時，PBEF過表達而啟動白細胞介素（IL）－8、IL－1β和腫瘤壞死因子－α（TNF－α）等炎性細胞因子大量表達，在急性肺損傷中發(fā)揮重要作用。本研究制備模型大鼠并分組檢測，發(fā)現(xiàn)C組的PBEF、磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE－cadherin、磷酸化FAK表達與A、B組和對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），可見PBEF高表達影響了磷酸化P38MAPK、磷酸化ERK、磷酸化MLC、磷酸化VE－cadherin、磷酸化FAK表達。P38MAPK、ERK是增殖信號通路中的關鍵分子，PBEF可能通過這些分子誘導VEGF和MMP2／9的表達。本研究中C組VEGF、MMP2、MMP9與A、B組和對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。有研究［12－15］報道VEGF在腎綜合征出血熱發(fā)病中的作用發(fā)現(xiàn)患者血管通透性增高可能與休克期VEGF高表達有關。本研究病理結果顯示，C組肺組織病理損害嚴重，A、B組較C組有不同程度的減輕。

綜上所述，PBEF通過P38MAPK、ERK等途徑調控磷酸化MLC、磷酸化VE－cadherin、磷酸化FAK表達，而且依賴MAPK／PI3K－Akt／VEGF信號轉導通路來誘導VEGF 和MMP2／9的表達，增加CPB術后肺血管內皮通透性。

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