GSK－3β、PTEN、PLK1在兒童急性髓系白血病中的表達及意義

王 妍，徐酉華，胡艷妮，孫艷輝，金 鑫，楊桂存

（重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院／兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點實驗室／兒科學重慶市重點實驗室／重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預防國際科技合作基地 400014）

急性白血病是兒童最常見的惡性腫瘤，傳統(tǒng)的化療和干細胞移植使兒童急性淋巴細胞白血?。ˋLL）的5年生存率達到80%，而急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）患兒的5年生存率只接近60%［1］。新型分子靶向化療藥物具有更強的抗腫瘤活性，且對正常細胞不良反應小。因此，尋找兒童AML的有效分子作用靶點至關重要。

糖原合酶激酶－3β（GSK－3β）是一種多功能的胞漿絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，研究證實它是治療2型糖尿病［2］、阿爾茨海默?。?］的有效藥物靶點，并且與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關［4］，但其在白血病中起激活作用還是抑制作用尚不明確。PTEN是第1個呈雙專一性磷酸酶活性的抑癌基因，它作為GSK3β的上游基因，可調(diào)控GSK3β的表達［5］。在成人急性白血病中存在與張力蛋白同源的位于第10號染色體磷酸酶基因（PTEN）基因的表達缺失［6］，但兒童 ALL患者骨髓標本中PTEN蛋白的表達高于非惡性疾病兒童［7］。Polo樣激酶1（PLK1）是一種高度保守的絲氨酸／蘇氨酸激酶，可促進有絲分裂的進程，其抑制劑BI2536已經(jīng)進入AML的Ⅰ期臨床實驗階段［8］。有研究認為GSK－3β可能是PLK1的負調(diào)控因子，在維系PLK1的功能方面發(fā)揮作用［9］。本課題組研究GSK－3β、PTEN、PLK1在兒童AML的表達和臨床的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實驗組為2012年3～9月重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院血液科收治的33例初診AML患兒骨髓（M12例，M215例，M36例，M41例，M56例，M62例，M71例 ；中位年齡6歲2個月）。按形態(tài)學、免疫學、染色體、基因（MICM）分型標準診斷。根據(jù)患兒的臨床以及實驗室指標按危險度分型將實驗組分為高危組、中危組、低危組，每組11例。對照組為10例骨科手術切除骨中抽吸的正常骨髓。

1.2 方法

1.2.1 標本處理 無菌操作取骨髓液2～3mL，肝素抗凝，聚蔗糖（FicoLL）液（相對密度1.077g／mL）分離骨髓單個核細胞（BMMNC），取約5×106個細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次，混勻后－80℃保存。

表1 GSK－3β、PTEN、PLK1、β－actin的引物及目的片段大小

1.2.2 裂解骨髓單個核細胞 離心沉淀細胞，加1mL裂解液RL充分裂解細胞。分別收集水相中的總RNA及有機相中的總蛋白。

1.2.3 RT－PCR檢驗 按北京百泰克生物技術有限公司高純總RNA快速提取試劑盒說明書提取RNA。按大連寶生物技術有限公司逆轉錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit Perfect Real Time說明書進行反轉錄。GSK－3β、PTEN、PLK1、βactin的引物及目的片段大小見表1，PCR條件：95℃預變性5 min；然后95℃變性30s；GSK－3β、PLK1、β－actin均為55℃退火30s，PTEN 60℃ 退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物分析 取PCR產(chǎn)物8μL在25～30g／L瓊脂糖凝膠中電泳，100V電泳45min。用紫外投射儀觀察并用粘膠成像儀照相，照片經(jīng)Metamorphose Imaging Sight軟件進行分析并讀取吸光度值，分別取GSK－3β、PTEN、PLK1與actin吸光度比值（GSK－3β／actin、PTEN／actin、PLK1／actin）進行半定量分析。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA） 采用ELISA雙抗體夾心法對有機相中的 GSK－3β、P－GSK－3β水平進行定量分析。操作步驟嚴格按上海滬尚生物有限公司 GSK－3β及P－GSK－3β ELISA試劑盒使用說明書進行。選擇450nm波長，在酶標儀上測定A值，以標準品A值繪制標準曲線。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用表示，兩組間的比較采用t檢驗；組間兩兩比較采用F檢驗；兩組間的相關性研究采用Pearson相關檢驗，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 GSK－3βmRNA、PTEN mRNA、PLK1mRNA 在兩組BMMNC的表達 實驗組GSK－3βmRNA和PLK1mRNA的平均表達量較對照組的平均表達量高（P＜0.05）；實驗組PTEN mRNA的平均表達量較對照組的平均表達量低（P＜0.05）。見表2、圖1。

表2 兩組GSK－3β、PTEN、PLK1的PCR檢測結果（）

表2 兩組GSK－3β、PTEN、PLK1的PCR檢測結果（）

組別 n GSK－3β 330.55±0.16 0.50±0.16 0.71±0.18對照組 100.41±0.09 0.63±0.25 0.57±0.18 P mRNA PTEN mRNA PLK1mRNA實驗組0.012 0.012 0.040

2.2 GSK－3β蛋白及P－GSK－3β蛋白在兩組BMMNC的表達情況 實驗組GSK－3β蛋白的平均濃度較對照組的平均濃度高（P＜0.05）；實驗組P－GSK－3β蛋白的平均濃度較對照組的平均濃度低（P＜0.01）。見表3。

圖1 兩組 GSK－3β、PTEN、PLK1的PCR檢測結果

表3 兩組 GSK－3β、P－GSK－3β的ELISA檢測結果（pg／mL，）

表3 兩組 GSK－3β、P－GSK－3β的ELISA檢測結果（pg／mL，）

組別 n GSK－3β P－GSK－3β 33 2553.40±358.59 294.17±40.53對照組 10 2204.02±283.52 350.53±53.32 P實驗組0.014 0.002

2.3 GSK－3βmRNA、PTEN mRNA、PLK1mRNA、GSK－3β蛋白及P－GSK－3β與臨床指標的相關性 實驗組GSK－3βmRNA、PTEN mRNA、PLK1mRNA、GSK－3β蛋白 及 P－GSK－3β的表達與性別、肝脾是否腫大均無明顯相關性，僅GSK－3β蛋白的表達與外周血白細胞計數(shù)增高呈正相關（P＝0.011）。臨床危險度高則 GSK－3βmRNA［高危組高于中危組（P＝0.012），高危組高于低危組（P＝0.000）］、GSK－3β蛋白［高危組高于中危組（P＝0.012），高危組高于低危組（P＝0.003）］、PLK1mRNA［高危組高于低危組（P＝0.009）］表達相應增高。臨床危險度高則P－GSK－3β表達減低［高危組低于中危組（P＝0.047），高危組低于中危組（P＝0.036）］。PTEN mRNA的表達與臨床危險度分型無明顯相關性。

2.4 GSK－3β與PTEN mRNA、PLK1mRNA表達的相關性本研究中 GSK－3βmRNA、P－GSK3β與 PTEN mRNA 的表達無明顯相關性（r＝－0.265，P＝0.136；r＝0.023，P＝0.899），GSK－3β蛋白與PTEN mRNA的表達呈負相關（r＝－0.415，P＝0.016）。GSK－3βmRNA、GSK－3β蛋白與PLK1mRNA 的表達呈正相關（r＝0.388，P＝0.026；r＝0.427，P＝0.013），P－GSK3β與PLK1mRNA的表達無明顯相關性（r＝－0.319，P＝0.070）。

3 討 論

分子靶向藥物在白血病治療中發(fā)揮越來越重要的作用。近來研究表明GSK－3β為癌基因，使用GSK－3β的抑制劑BIO后TF－1、U937、K562和HL60細胞大量凋亡，但不影響正常造血干細胞的活性［10］。另有研究表明GSK－3β為抑癌基因，在APL中，ATO激活GSK－3β誘導 Mcl－1降解進而誘導NB4細胞分化［11］。本課題組前期研究表明兒童ALL中GSK－3β起癌基因的作用［12］。本實驗結果顯示兒童AML中GSK－3β在基因及蛋白水平均高表達，且表達水平與臨床分型呈正相關，GSK－3β蛋白與外周血白細胞計數(shù)呈正相關；P－GSK－3β低表達，與臨床分型呈負相關。因此，GSK－3β在兒童AML中可能同樣起癌基因的作用。

本研究中兒童AML骨髓標本中PTEN mRNA的表達量明顯低于對照組，其在兒童AML中可能起抑癌作用，但其表達量與臨床指標無相關性。

PLK1目前被認為是腫瘤治療過程中有價值的作用靶點，在AML動物模型中，PLK1的特異性的抑制劑NMS－P937聯(lián)合阿糖胞苷口服后，可使其較好地長期存活［13］；在成人AML中PLK1高表達，與不良預后呈明顯正相關［14］。本研究中兒童AML骨髓標本中PLK1mRNA的表達量同樣明顯高于對照組，且其表達量與臨床分型呈一定正相關，表明PLK1在兒童AML中可能同樣起癌基因的作用。

腫瘤中抑癌基因PTEN主要通過兩種作用途徑調(diào)控GSK－3β的表達：一種為通過降低對PI3K／AKT信號通路的抑制，增強AKT對GSK－3β的抑制性磷酸化，GSK－3β的表達減少［5］；一種為通過增強對cdc42活性的抑制，降低cdc42信號通過對GSK－3β的抑制作用，GSK－3β的表達增加［15］。本研究初步顯示兒童AML中，GSK－3β蛋白與PTEN mRNA的表達呈現(xiàn)一定負相關。因此，兒童AML中，PTEN可能主要通過cdc42信號通路調(diào)控GSK－3β的轉錄后水平的表達。

在肺癌中，GSK－3β的抑制劑LiCl能增強PLK1的啟動子活性，促進PLK1的表達，提示GSK－3β可能是PLK1的負調(diào)控因子［9］。而本研究結果顯示 GSK－3βmRNA、GSK－3β蛋白與PLK1mRNA的表達呈正相關。本課題組前期研究表明兒童ALL中 GSK－3β高表達，且其正向調(diào)控 NF－κB信號通路［12］。Lin等［16］研究表明 NF－κB的亞基 RelA 通過直接與PLK1的啟動子結合，增強PLK1的轉錄。因此，在兒童AML中，GSK－3β可能通過正向調(diào)控 NF－κB信號通路從而增強PLK1的轉錄。

綜上所述，兒童AML中，GSK－3β和PLK1可能起癌基因的作用，而PTEN起抑癌基因的作用，三者在白血病中的作用機制有待進一步探討，可能成為兒童AML危險度分型的指標及靶向治療的有效作用靶點。

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